植物花粉生活力測定技術

在育種工作中，有時需要將花粉保存一段時間。雖然人們已經知道，花粉保存以溫度較低（0～15℃），空氣濕度稍干（不能太干）、黑暗條件下為宜。但是各種不同植物  花粉壽命長短相差懸殊，這一是由花粉本身的特征決定的，二是由貯藏條件決定的。一般來說，禾谷類作物花粉的壽命較短，自花授粉植物花粉的壽命尤其短，如小麥在花藥開裂后30min，花粉即由鮮黃色變為深黃色，此時已有大量花粉喪失活力。在許多特殊條件下，花粉的生活力的測定顯的很重要，如：
1．外地采集來的花粉或雜交時父本花期早于母本時都要將花粉進行短暫貯藏；
2．自交或遠緣雜交時，為了分析結實率或不結實原因時；
3．為了鑒定雄性不育系時；
4．了解某些雜交技術時，如測定花粉的刺激等作用，測定受精選擇性等。
因此，要根據各種植物花粉的特點，采取適當的保存方法。花粉生活力的測定方法很多，其中發芽試驗手續較復雜，設備要求較高，需時也較長。為了簡易而迅速的測定花粉生活力，也常采用化學染色的方法，但是此法也有缺點，就是染上色的花粉不一定都具有生活力，因為染上色的花粉中也包括了那些生活力弱不能正常發芽的花粉，所以一般常用而且較為可靠的方法仍然是采用花粉發芽實驗。要是要求不嚴格對新采集的花粉還有一個較簡便的鑒定方法——形態鑒定法。
本實驗目的是學習花粉生活力測定的方法，進而研究花粉壽命長短與環境條件的關系，以探求保存花粉的合適方法。
一、試材及用具
1．材料：幾種植物的不同處理花粉；如：小麥、玉米、大白菜、黃瓜、杏、蘋果等。
2．試劑：配制好的緩沖液、聯苯胺液、過氧化氫液、TTC粉、蔗糖、瓊脂  等；
3．用具：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、凹面載玻片、玻璃棒、擦鏡紙、吸水紙、標簽紙、鉛筆。
二、方法步驟
（一）直接檢驗法
每個實驗小組選定同品種種株去雄。注意：選用的花蕾最好是花前1～2d，且發育正常、飽滿。每天去雄20個花蕾，然后套袋隔離，連續5d，共100朵花。這一實驗要和花粉貯藏實驗相配合，即花粉貯藏的當天開始去雄。授粉時，每去雄一次，分別授以兩種不同貯藏條件下的花粉（各10朵），連續5d，就使得貯藏期分別為當天、第二天、第三天、第四天、第五天的花粉授到了去雄后的花蕾上。實驗時，一定要掛牌標好品種、花粉貯藏期、貯藏條件、株號、授粉日期、授粉人。等最后一個處理完后十天，檢驗結實率和結籽率。將得到的結果填入表1－6。
（二）染色鑒定法（TTC法）
TTC即2、3、5－三苯基四唑氯化物。主要原理在于檢驗花粉呼吸過程中去氧酶的活性。具有生活力的花粉的脫氫酶，在催化去氫的過程中，把氫轉移到其他的物質上去，使用TTC與催化過程中產生的氫結合成紅色化合物，從而使具有生活力的花粉變為紅色。
1．先配制下列溶液
（1）磷酸緩沖液  ：在100毫升的蒸餾水中，溶解0.832克的磷酸氫二鈉和0.273克的磷酸二氫鉀，調整PH值為7.17。
（2）TTC溶液：稱取0.02～0.05克（不同植物所用的量是不同的）的TTC溶解在10ml的磷酸緩沖液中，溶液配好后裝入棕色滴瓶內，置入暗處，因氯化三苯基四唑有毒，操作時要注意安全。
2．操作步驟：
（1）取少量花粉放在載玻片上，并在花粉上滴上1～2滴配制液，用玻璃棒混合后蓋上蓋玻片。
（2）將載玻片置于恒溫箱中（35～40℃）約15～20min。
（3）在顯微鏡（10×10）下觀察：凡具有生活力的花粉呈紅色，部分喪失生活力的呈淡紅色，無色的是死的和不育的花粉粒。
3．觀察和測定結果：每片觀察3個視野，并統計具有生活力花粉的百分率，填入表1－6。
（三）發芽測定法（培養基培養法）
1．培養基的配制
常用的花粉發芽培養基有液體和固體兩種。以前者最為簡便。本實驗選用前者。其有效成分主要有：蔗糖、硼酸、檸檬酸、赤霉素等。不同的植物所用的蔗糖培養液的濃度是不同的，配制3～30%的蔗糖培養液：在100ml水中，加糖3～30g，加熱溶解后，再加0.1%硼酸數滴。
2．制片
取雙凹載玻片，滴2滴培養液于槽中，用解剖針挑少許花粉均勻撒于培養液的表面（注意不必攪拌，以防花粉混于液體中因缺少空氣而影響發芽，又因花粉深淺不一而在顯微鏡檢查時因光線折射而不易觀察。）處理好后，放于一下部添有少量蒸餾水、內有兩根玻璃棒的培養皿中（注意不要使水沒過載玻片），放到恒溫為25℃左右的恒溫箱中或室內2h。
3．鏡檢
將放置2h后的載玻片取出，放在顯微鏡下觀察三個視野，統計總花粉數與發芽的花粉數，然后計算比例，填入下面的表格中。
（四）形態鑒定法
對于新采集的花粉來說，還有一個更為簡便的鑒定方法——形態鑒定法。將花粉用解剖針播于一般載玻片上，然后直接放到顯微鏡下觀察，根據形態特征，判斷花粉的生活力狀況，一般來說，畸形、皺縮、小形化等均為無生活力花粉，而有光澤、飽滿、具有本品種花粉典型特征等性狀的均為有生活力花粉。