使用 IPGphor 進行 IEF 的典型工作條件見表13-2和 表 13-3 。正如前文指出的那樣
，為了使高分子質量的蛋白質更好地進入聚丙烯酰胺膠內，水化時應在膠條兩端加低電壓（30~50 V ) ，否則將給水化上樣造成困難[ 15，28]
。然后電壓逐步升高至 8000 V。如果 IPG 膠條的分離長度 < 11 cm，電壓應限制在 5000 V
內。為在分離含鹽量高的樣品或使用窄 pH 間隔分離樣品時得到最佳效果，在電壓升髙至 8000 V 之前可在電極和 IPG
膠條之間墊上濕潤的濾紙片（尺寸：4mm X 4mm) ( 見注釋 4 ) 。當 IEF 結束后，按13. 3.1 節 2. 第 13
步中的方法貯存 IPG 膠條。
1 ) 水化上樣 IEF
( 1 ) 將所需數量的持膠槽放在冷卻盤或 IPGphor 的電極區（圖 13-2 ) 上。吸取適量 （如 180 mm 長 IPG 膠條吸取 350 μl）的含有樣品的 IPG 干膠條水化液注入持膠槽中，將 IPG 膠條膠面朝下放入水化液中，然后用 IPG 干膠條覆蓋油覆蓋。具體方法見 13. 3.1 節 1. 2) 。
( 2 ) 設置 IPGphor ( 所需的水化時間、伏小時、電壓梯度）。
( 3 ) IPG 膠條水化后（至少需要 6 h，通常過夜），按表 13-2 所列參數開始 IEF。
( 4 ) IEF 完成后，將那些不立刻進行第二向電泳的 IPG 膠條夾在兩層塑料膜之間貯存于 -70°C。
2 ) 杯上樣 IEF
( 1 ) 在水化盤中用不含樣品的水化液水化 IPG 干膠條。IPG 膠條水化后，用干凈的鑷子將水化好的 IPG 膠條從水化盤或水化盒中取出。用去離子水沖洗膠條，然后將膠條放在兩層濕潤的濾紙之間，用濾紙吸膠條上多余的覆蓋油幾秒。這樣能夠防止 IEF 過程中尿素在膠表面結晶。見 13. 3.1 節 2. 。
( 2 ) 將所需數量的杯上樣持膠槽放在冷卻盤或 IPGphor 的電極區上，確保持膠槽的尖端（陽極）與電極區的陽極區相連。可以使用復合式持膠槽代替獨立持膠槽。
( 3 ) 將水化好的 IPG 膠條放入杯上樣持膠槽（或復合式持膠槽）中，膠面朝上且膠條尖端（酸性端）對準陽極。確保 IPG 膠條的陰極距離槽的末端約 1.5 cm 且通過電極絲與電極連通。
( 4 ) 用去離子水潤濕兩張電極濾紙墊片（尺寸：4 mmX10 mm) ，用濾紙吸掉過多的去離子水，然后將潤濕的電極濾紙墊片放在陽極和陰極電極與 IPG 膠條之間 IPG 膠條的表面上。如果必要（如當樣品含鹽量高），數小時后可以更換新的濾紙墊片。
( 5 ) 將活動電極放在電極濾紙墊片上。夾緊電極使其緊壓電極濾紙墊片。
( 6 ) 將可移動的上樣杯放在陽極或陰極附近，然后輕輕將上樣杯壓在 IPG 膠條表面上。上樣杯應與 IPG 膠條緊密接觸但不能損傷膠條表面。
( 7 ) 為確保上樣杯不漏液，向杯中加入 100 μl IPG 覆蓋油。如發現漏液，除去覆蓋油并用綿紙吸凈覆蓋油，然后重新放置上樣杯。再次檢查是否漏液。上樣前吸出覆蓋油。
( 8 ) 每根膠條用 2~4 ml IPG 膠條覆蓋油覆蓋（建議不要使用硅樹脂油或煤油替代 IPG 膠條覆蓋油）。萬一覆蓋油漏入上樣杯，重新放置上樣杯并用綿紙吸凈杯中的覆蓋油。再次檢查是否漏液，然后吸取樣品（20~100 μl ) 加入上樣杯。
( 9 ) 設置儀器（所需伏小時、電壓梯度、溫度等）并按表 13-2 和表 13-3 中推薦的參數進行 IEF。省去表 13-2中為水化上樣推薦的低電壓水化步驟。
( 10 ) IEF 完成后，繼續進行平衡或第二向 IEF ( SDS-PAGE ) ( 見 13.3.3 節），或將 IPG 膠條夾在兩層塑料膜之間貯存于 -70°C，可貯存數月。
3.2 IPG 膠條平衡
在進行第二向分離（SDS-PAGE ) 之前，平衡 IPG 膠條使膠條中分離的蛋白質與 SDS 充分作用十分重要。由于與載體兩性電解質凝膠相比，聚焦后的蛋白質與 IPG 膠條的結合更加緊密，因此需要相對長的平衡時間（10~15 min) 以及尿素和甘油來改善蛋白質在第一向和第二向之間的轉移效果。其中尿素和甘油可以減輕電滲作用的影響。目前最常用的步驟是將 IPG 膠條在一種最初由 Gorg 等 [13] 提出的緩沖液 [ 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.8) 、2% (m/V ) SDS、1% ( m/V）DTT、6 mol/L 尿素、30% (m/V) 甘油；表 13-4 中平衡 10~15 min。然后再將膠條在把上述緩沖液中的 DTT 換成 4% ( m/V ) 碘乙酰胺后形成的緩沖液中進一步平衡 10~15 min。后面的步驟是用來烷基化游離的 DTT，否則 DTT 會在第二向 SDS-PAGE 膠中遷移，從而導致點拖尾現象。該現象在銀染之后就會被觀察到。更重要的是，碘乙酰胺會烷基化巰基并阻止它們的氧化還原作用。我們強烈推薦使用這種還原/烷基化兩步程序，這是因為它能夠相當程度上簡化后續質譜鑒定的樣品制備工作（膠內消化蛋白質）。平衡后，IPG 膠條被放在第二向水平或垂直 SDS-PAGE 膠的表面。
( 1 ) 溶解 100 mg DTT ( Sigma-Aldrich ) 至 10 ml 平衡液中以配制平衡液 I 。
a. 為每根膠條準備 10 ml。
b. 將每根聚焦后的膠條放入一個試管（250 mm 長 ，內徑 20mm) 中，在每個試管中加入 10 ml 平衡液 I 。
c. 試管用 Pamfilm 密封后在搖床上搖動 15 min，然后倒出平衡液。也可使用較短的平衡時間（10 min) ，不過這樣做的風險是在樣品進入 SDS-PAGE 膠時一些蛋白質可能不會從 IPG 膠條中出來。如果這樣，應當在把 IPG 膠條從 SDS 膠上取下后將 IPG 膠條染色，以檢查是否所有的蛋白質離幵了 IPG 膠條。
( 2 ) 溶解 0.4 g 碘乙酰胺（Sigma- Aldrich) 至 10 ml 平衡液中以配制平衡液 Ⅱ。
a. 為每根 IPG 膠條準備 10 ml。
b. 向每根膠條加入 10 ml 平衡液Ⅱ和 50 μl 作為 SDS-PAGE 指示劑的溴酚藍（Serva) 溶液，再次輕輕搖動平衡 15 min。
( 3 ) 倒出平衡液Ⅱ，進行 SDS-PAGE ( 見 13.3.3 節）。如果用水平電泳槽（ 如 Muhiphor Ⅱ ) 進行 SDS-PAGE ，用去離子水短暫地沖洗 IPG 膠條，然后將膠條放在一張濾紙的一邊，等待幾分鐘以吸凈多余的平衡液。如果用垂直電泳槽（如 EttanDalt ) 進行 SDS-PAGE，用電極緩沖液短暫地沖洗 IPG 膠條。