植物過氧化物酶測定

實驗概要

本文介紹了植物過氧化物酶同工酶測定的基本原理及操作步驟等。

實驗原理

聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚合而成，具有三維網狀結構，其網孔大小可由凝膠濃度和交聯度加以調節。凝膠電泳兼有電荷效應和分子篩效應。被分離物質由于所載電荷數量、分子大小和形狀的差異，因此在電泳時產生不同的泳動速率而相互分離。利用特異性的顏色反應使待測酶著色，這樣就可在凝膠中展現出酶譜。過氧化物酶是植物體內常見的氧化酶。植物體內許多生理代謝過程常與它的活性及其同工酶的種類有關。利用過氧化物酶能催化H₂O₂把聯苯胺氧化成藍色或棕褐色產物的原理，將經過電泳后的凝膠置于有H₂O₂及聯苯胺的溶液染色，出現藍色或棕褐色部位即為過氧化物酶同工酶在凝膠中存在的位置，多條有色帶即構成過氧化物酶同工酶譜。本實驗利用連續的盤狀凝膠電泳，采用Tris－Gly緩沖系統來分離陰離子過氧化物酶同工酶。

主要試劑

1. 分離膠緩沖液（pH8.9）：1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加水定容至100ml。

2. 分離膠貯液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉雙丙烯酰胺，加水溶解并定容至100ml，過濾后使用。

3. 過硫酸銨溶液：過硫酸銨0.2g，加水定容至100ml制膠時現配現用）。

4. 濃縮膠緩沖液：1mol/L HCl48ml＋Tris5.98g＋TEMED0.46ml，調pH6.7，并定容至100ml。

5. 濃縮膠貯備液：丙烯酰胺10g，甲叉雙丙烯酰胺 2.5g加水定容到100ml，使用前過濾。

6. 電極緩沖液：Tris 6.0g，Gly 28.8g，用水定容至1000ml（pH8.3），用前稀釋10倍。

7. 四甲基乙二胺（TEMED）。

8. 0.1%的溴酚藍水溶液。

9. 聯苯胺染色母液：聯苯胺1g＋冰醋酸18ml＋H₂O₂ml溶解貯于棕色瓶中。

主要設備

1. 穩流穩壓電泳儀；

2. 冷凍離心機及離心管；

3. 成套電泳槽（圓盤型）；

4. pH試紙；

5. 其它常規用具。

實驗材料

小麥芽

實驗步驟

1. 安裝電泳槽

2. 凝膠的配制

3. 過氧化物酶的提取：稱取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內，加入1mlH₂O或0.05mol/L Tris－HCl緩沖液（pH6，8）研成勻漿，轉入離心管，再用2ml前述溶液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉入離心管，3500rpm離心 15～20min，其上清液即為酶的提取液，供電泳分析用。

4.   點樣：用微量注射器吸取上清液，每管加樣50μl，再分別加入40%蔗糖溶液5μl，之后再用注射器將電極緩沖液慢慢加入每支膠管至浸沒頂部為止.最后向上、下電泳槽倒入電極緩沖液（上槽必須淹沒管頂，下槽液要能浸泡著凝膠管），最后在上槽液中滴入1～2滴溴酚藍溶液。

5. 電泳：將電泳槽放至低溫處，最好在4℃左右，或接通電泳槽水冷卻系統按上“一”下“＋”接好導線，通電，電泳開始電流應低，每管 1mA，10min后，再加大電流，使每管達到2～3mA，當溴酚藍指示劑達到距管底約25px處時，切斷電流，停止電泳。

6. 剝膠：電泳完畢，將電泳槽取出，倒去緩沖液，取下凝膠管，放入培養皿中。用一個帶有長針頭的注射器，吸滿水，將針頭沿管壁插入，同時慢慢地將注射器中的水推出，并不斷轉動凝膠管，將凝膠管擠脫出來，也可用洗耳球擠壓。

7. 染色：取0.5ml聯苯胺母液＋H₂O 9.3ml＋0.2ml3%H₂O₂，混勻后倒入盛有凝膠條的培養皿。此時可以看到膠條上出現藍色或棕褐色環，即過氧化物酶帶，約十min后用自來水沖洗，這時藍色帶也慢慢變成棕褐色。

8. 記錄酶譜，并計算各同工酶的遷移率。