一、原理
酶和蛋白質是基因表達的產物，基因位于染色體上。當某一對同源染色體缺失時，位于這對染色體上的基因和它們所編碼的酶或蛋白質也就隨之丟失。以正常小麥及其缺體系為材料，通過蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳和同工酶分析，即可確定編碼這些酶或蛋白質的基因在基因組中的定位（位于哪對染色體上）。
酯酶是催化酯類化合物水解的酶系，在細胞代謝過程中起重要作用。電泳分離后，凝膠中的酶催化底物a-或b－乙酸奈酯水解，水解產物與堅牢蘭RR鹽作用形成褐色或紅色的復合物，借此可以鑒定酯酶同工酶的存在、數量和酶活性的大小。
二、目的
通過本實驗，可以進一步了解染色體與基因、基因與酶蛋白的關系，加深對于酶是基因表達產物的認識。同時掌握利用缺體品系進行酯酶同工酶基因定位的方法。
三、材料、試劑
1、正常小麥及其缺體系萌發種子或幼苗。
2、Acr-Bis貯備液：30％Acr-0.8%Bis水溶液。
3、Tris-檸檬酸緩沖液(pH 6.8)：1.55g Tris, 0.1g檸檬酸，100ml。
4、Tris-檸檬酸緩沖液 (pH 8.9)：15.5g Tris, 1g檸檬酸，1000ml。
5、1.247%EDTA溶液。
6、15過硫酸胺。
7、TEMED。
8、樣品提取緩沖液：0.1M Tris-HCl, pH 7.5, 5% (W/V)蔗糖，0.1M 巰基乙醇。
9、10×電極緩沖液：6.2g Tris, 2g Gly, pH 8.7, 1000ml。
10、a-乙酸奈酯儲備液：20mg/ml，溶于丙酮中。
11、堅牢蘭RR鹽儲備液：20mg/ml，溶于丙酮中。
12、磷酸緩沖液：0.1M, pH6.4。
13、1％瓊脂糖。
14、加樣緩沖液：30％甘油，0.05%溴酚蘭。
四、操作步驟
（一）凝膠模具的裝配
1、將裝配凝膠模具所用的玻璃板、橡膠框、樣品梳等用具洗凈，晾干。
2、將兩塊玻璃板固定于橡膠框上，用滴管吸取融化的瓊脂糖封住底邊。
3、瓊脂糖凝固后，將玻璃板及橡膠框一邊裝在電泳槽上。
（二）凝膠的配制
1、取一個干凈燒杯，按表中分離膠的組成依次加入相應的組分，混合。
2、將凝膠板模具稍傾斜，把分離膠溶液沿兩塊玻璃板上方緩慢倒入，注意防止產生氣泡。當液面距頂端3cm時停止灌膠。
3、將膠模垂直放置，在膠液表面用注射器小心覆蓋一層蒸餾水（約3mm），室溫下聚合。水和膠液兩相間出現界面時，表面聚合已經完成。
4、再取一個干凈燒杯，按表中濃縮膠的組成配制濃縮膠，混合。
5、用注射器和濾紙吸去分離膠表面的水分，將濃縮膠緩緩倒在分離膠上部，當液面距玻璃板頂部3mm時，立即插入樣品梳，室溫下聚合。
表18－1 分離膠和濃縮膠的配方
| 分離膠濃度 | 濃縮膠濃度 | |||
| 7％ | 10％ | 3％ | 4％ | |
| 30%Acr-0.8%Bis(ml) | 4.5 | 6.5 | 1.0 | 1.3 |
| Tris-檸檬酸pH8.9(ml) | 14.2 | 12.2 | … | … |
| Tris-檸檬酸pH6.8(ml) | … | … | 1.0 | 1.3 |
| 1.247% EDTA(ml) | 0.8 | 0.8 | 0.1 | 0.2 |
| 1%AP(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.3 | 0.3 |
| TEMED(ul) | 20 | 20 | 15 | 15 |
| ddH2O(ml) | … | … | 7.6 | 6.9 |
| 總體積(ml) | 20 | 20 | 10 | 10 |
（三）樣品提取
1、將待測材料用蒸餾水沖洗后，用濾紙吸干。稱取所需樣量(0.2-0.5g)。
2、剪碎，置于沖浴研缽中，加入2倍體積的樣品提取液，勻漿。
3、將勻漿轉入1.5ml微量離心管，10000rpm離心10分鐘。
4、收集上清液，置4℃冰箱中保存備用。
（四）電泳
1、濃縮膠聚合后，拔出樣品梳，加入電極緩沖液，接好電源。
2、吸取30－50ul樣品液，加入1／3的30％甘油溶液，混勻。
3、用微量加樣器吸取50－80ul混合好的樣品，緩慢加入到加樣孔中。
4、接通電源，上槽接負極。在20V/cm穩壓條件下電泳3小時左右。指示劑距前沿1cm時停止電泳。
（五）染色
1、取下凝膠，切去濃縮膠，用水沖洗后，置培養皿中。
2、將200ml 0.1M磷酸緩沖液(pH 6.0), 10ml a-乙酸奈酯和10ml堅牢蘭RR鹽混合，倒入培養皿中。
3、37℃恒溫箱內保溫染色，待褐色的酶帶顯示清楚后，用蒸餾水沖洗并保存。
4、在X射線觀察燈上觀察照相，或用薄層掃描儀掃描進行定性定量分析。