植物（動物）細胞核差速離心分離

線粒體和細胞核的制備與觀察

利用細胞核與線粒體在一定介質中的沉降速度的差異，可采取分級差速離心的方法，將細胞核與線粒體逐級分離出來。（差速離心技術）

線粒體是真核細胞特有的進行能量轉換的重要細胞器。將動植物組織制成勻漿，在適當的懸浮介質中差速離心法可以分離細胞線粒體。在一定的離心場中（選用離心機的一定轉速），球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質的黏度。在一均勻的懸浮介質中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其它內含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器沉降先后順序先后是細胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。

懸浮介質通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細胞質的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結構和酶的活性；pH7.2的條件下，亞細胞組分不容易聚集成團，有利于分離。整個操作過程樣品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。

細胞器標記酶的測定是評價細胞器內膜組分和分離純度的主要依據，如線粒體內膜上分布有細胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態呈現藍綠色，從而使線粒體顯色，而胞質中的染料被還原成無色。

詹納斯綠B是一種活體染料，能對動植物的細胞或組織在活體狀態下進行無毒害的染色。由于染料（堿性染料）的膠粒表面帶有陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染部分本身具有陽離子或陰離子，這樣，它們彼此之間發生吸引作用，染料就被堆積下來。染色法可以顯示出活細胞內的某種天然結構存在的真實性，而不影響細胞的生命活動和產生任何物理、化學變化以引致細胞的死亡。

Gimesa是一種復合染料，即為酸性染料與堿性染料的結合物。在水溶液中電離為帶正電和負電的染料離子。

***材料： 鼠肝臟， 豬肝臟

***試劑：
　　（1）0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）-鹽酸緩沖液（pH7.4）
　　 0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液10ml
　　0.1mol/L鹽酸8.4ml
　　加雙蒸水到100ml，再加蔗糖使濃度為 0.2mol/L

（2） 0.34mol/L蔗糖-0.01mol/LTris-鹽酸緩沖液（pH7.4），配法同上。

（3） 1%詹納斯綠B（Janus green 染液，稱取50mg（pH7.4），詹納斯綠B溶于5ml生理鹽水中，稍微加熱使之溶解后，過濾，即為1%原液。

（4） 姬姆薩染液（Giemsa）：稱取姬姆薩粉0.5g，甘油33 ml 、純甲醇33ml。先在姬姆薩粉中添加少量甘油，然后在研缽內研磨至無顆粒狀，再將剩余甘油倒入混勻，56℃左右保溫2h使其充分溶解，最后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。使用時吸出少量，用1/5mol/L磷酸緩沖液作10~20倍稀釋。

（5） 1/15 mol/L磷酸緩沖液?（pH6.8）
　　1/15 mol/ L磷酸二氫鉀 （KH2PO4）50 ml
　　 1/15 mol/ L磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 50 ml

卡諾（Cornay）固定液：無水乙醇 6 ml 冰醋酸 1 ml 氯仿 3 ml

（7）生理鹽水

***儀器（請參看儀器圖庫）：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃勻漿器，尼龍織物，刻度離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機。

1、制備肝細胞勻漿：實驗前將鼠空腹12小時，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干水，稱取肝組織1 g，剪碎；用預冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗滌數次。然后按每克肝加9 ml預冷的0.25mol/L蔗糖溶液的量，分數次添加蔗糖溶液，在0℃~4℃冰浴中用玻璃勻漿器將肝制成勻漿，，肝勻漿用雙層紗布過濾（濾液制一張涂片 ①，自然干燥）.

2、差速離心：將0.34 mol/ L 蔗糖溶液4.5 ml放入離心管，然后沿管壁小心地加入4.5 ml鼠肝勻漿覆蓋于上層。用冷凍控溫的高速離心按下圖順序進行差 速離心。
分離細胞核

鼠肝1克勻漿
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　　勻漿過濾
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　　濾液（制涂片一張①）
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　　將濾液 4.5mL覆蓋于相同容積的0.34mol/L蔗糖溶液上
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　　700×g離心10min
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　　↓　 ↓
　　沉淀（細胞核及碎片） 上清液1（制一張涂片②，自然干燥）
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　　洗滌（0.25mol/L預冷蔗糖溶液 5mL洗滌兩次）每次1000×g
　　離心15min
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　　　　　　沉淀（細胞核） 上清液2（與上清液1合并）

分離線粒體

混合上清液10000×g離心10
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　　沉淀（線粒體） 上清液（棄去）
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　　洗滌，加 0.25mol/L預冷
　　蔗糖溶液10mL ，10000×g離心
　　10min，重復洗滌兩次
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　　沉淀（線粒體） 上清液（制一張涂片③后棄去）

3、分離物鑒定：

（1） 細胞核：將干燥后的三張涂片加入Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min，蒸餾水漂洗數秒，用濾紙吸干水，用顯微鏡（40×）檢查，細胞核呈紫紅色，混雜的細胞質為淺藍色碎片。（涂片過程）

（2） 線粒體：取線粒體沉淀滴在載玻片上，勿太密。滴加 1%詹納斯綠溶液染色，10分鐘后用光學顯微鏡觀察，線粒體呈藍綠色，小棒狀或啞鈴狀。

試驗全過程要在0～4℃進行，如果使用非冷凍控溫的離心機一般只宜分離細胞核和線粒體，同時注意使樣品保持冷凍；盡可能充分破碎組織，縮短勻漿時間。整個分離過程不宜過長。