植物DNA提取實驗用于:(1)獲得較純的真核細胞基因組DNA;(2)后續PCR分析,RFLP分析,基因文庫的構建,基因探測等的研究。
| 實驗方法原理 | 這是一種快速簡便提取植物總DNA的方法。先將新鮮的葉片在液氮中研磨,以機械力破碎細胞壁,然后加入十六烷三甲基溴化銨分離緩沖液,使細胞膜破裂。同時將核酸與植物多糖等雜質分開(十六烷三甲基溴化銨,簡稱CTAB,是一種陽離子去污劑),再經氯仿-異戊醇抽提去除蛋白,即可得到適合于酶切的DNA。 |
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| 實驗材料 | 幼嫩的植物材料 |
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| 試劑、試劑盒 | 液氮CTAB抽提緩沖液NaACTris-HCl EDTA氯仿異戊醇TE buffer |
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| 儀器、耗材 | 瓷研缽離心管離心機 |
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| 實驗步驟 | 一、實驗試劑及材料 1. 材料:幼嫩的植物材料0.5g左右。 2. 試劑:液氮,CTAB抽提緩沖液:2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化銨),1%β-巰基乙醇 1.4mol/L Nacl,20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris-Hcl pH8.0,3M NaAC,50mM Tris-HCl pH8.0,20mM EDTA,氯仿:異戊醇(24:1),異丙醇 ,70%乙醇,TE buffer。 二、實驗方法 1. 取0.5 g植物材料,雙蒸水洗凈,并用濾紙吸干。 2. 植物材料剪成1 cm左右碎片,放入預冷的瓷研缽中。 3. 加入液氮速冷,研磨成細粉(越細越好)。 4. 在5 ml離心管中加入抽提緩沖液2.5 mll,60℃保溫1小時。 5. 15 000 rpm,離心10分鐘。上清轉入另一個新的離心管中。 6. 加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),混勻抽提至水乳膠融狀。 7. 15 000 rpm,離心10分鐘。 8. 上清轉入另一個新的離心管中。 9. 加入2/3倍體積預冷異丙醇,-20℃保溫30 min-1 h,緩緩混勻DNA成絮狀折出。 10. 15 000 rpm,離心10分鐘,棄上清。 11. DNA沉淀用 70%乙醇洗2次。 12. 加入400 ul TE buffer溶解DNA。 收起 |
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| 注意事項 | 真核細胞基因組較大,在操作中應注意動作輕柔,且在低溫下進行,以最大限度地減少機械和化學作用對DNA的剪切,從而獲得相對完整的DNA。 |
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| 其他 | 以下幾點可能會有所幫助: 1. 堅持使用2-巰基乙醇和PVP; 2. 取幼嫩一點的材料; 3. 低溫; 4. 快速; 5. 酚氯仿抽提離心后, 小心吸取上清液, 求質量而不求數量; 6. 壓軸的一點技巧, 酚氯仿抽提時盡可能充分混勻。 |
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