植物RNA提取實驗——液氮研磨法

獨特的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解細胞和滅活細胞RNA酶，植物RNA助提劑PLANTaid幫助結合多糖多酚并通過離心去除，然后用乙醇調節結合條件后，RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質去除， 最后低鹽的RNase free H₂O將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。

植物組織

β-巰基乙醇乙醇蛋白液RW1漂洗液RW蒸餾水無菌水

離心管離心機移液器移液管槍頭盒針頭注射器吸附柱液氮罐

一、取500 ul裂解液RLT(已經加入β-巰基乙醇)，轉入1.5 ml離心管中，加入50 ul PLANTaid混勻備用。
 

二、液氮中研磨適量植物組織成細粉后，取50 mg細粉轉入上述裝有RLT和PLANTaid的離心管，立即用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。

在56℃溫育1-3分鐘有助于裂解植物，但是淀粉含量高的植物不能溫育，因為提高的溫度可能導致淀粉膨脹。
 

三、用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9 mm針頭) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高產量。
 

四、將裂解物13，000rpm離心5-10分鐘，沉淀不能裂解的碎片和結合有多糖多酚的PLANTaid，將所有裂解物上清轉到一個新離心管。
 

五、較精確估計裂解物(上清)體積，加入0.5體積的無水乙醇，此時可能出現沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。
 

六、將混合物(每次小于700 ul，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13 000 rpm離心60秒，棄掉廢液。
 

七、加700 ul 去蛋白液RW1，室溫放置30秒，12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。
 

如果DNA殘留明顯,可在加入RW1后室溫放置5分鐘后再離心。
 

八、加入500 ul漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500 ul漂洗液RW，重復一遍。
 

九、將吸附柱RA放回空收集管中，13 000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
 

十、取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30-50 ul RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加熱效果更好）， 室溫放置1分鐘，12 000 rpm 離心1分鐘。
 

十一、如果預期RNA產量>30 ug，加30-50 ul RNase free water重復步驟七，合并兩次洗脫液，或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。
 

洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高，分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產量比前者高15-30%，但是濃度要低，用戶根據需要選擇。