1、診斷標準:接觸史,有非婚性接觸史、配偶感染史或間接感染史。
2、實驗室檢查:皮損活檢,有HPV感染的特征性凹空細胞的組織病理學變化特點。
必要時在皮損活檢中用抗原或核酸檢測顯示有HPV。常見的是HPV6、11型,少見為HPV16、18型。
3 、病例分類:報告病例,具備1.1及1.2指標。確診病例,具備1.1,1.2及1.3中的任何一項指標。
4、治療原則:注意患者是否同時有淋球菌、衣原體、支原體、滴蟲、霉菌等病原體感染,如有,應同時治療。
患者配偶與性伴若有尖銳濕疣或其他性病,應同時治療。治療期間避免性生活。
(二)PCR擴增
1、 引物設計和合成:HPV基因組可分為早期區(E)和晚期區(L),每區含一系列開放讀碼框架(ORF)。序列分析表明,各型HPV的非編碼區及E1、E6、E7和L1區均有保守序列。Manos等從HPVL1區中選擇保守序列設計合成引物MY11和MY09見表1,該引物與HPV 6、11、16、18及33型有互補序列,也可擴增其它型HPV。
2、PCR反應試劑:Taq DNA聚合酶(2U/ml)、10mmol/L dNTP貯備液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L),10×PCR緩沖液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5),100μmol/L MY11和MY09貯備液,滅菌的玻璃蒸餾器制備的蒸餾水。
3、PCR擴增方法和程序:以100μl PCR反應液,用無菌0.5ml硅化塑料離心管為反應管進行擴增反應。
(1)實驗前配制預混反應試劑并分裝。預混反應試劑包括除標本DNA外的其它各種PCR反應試劑。
(2)各反應管依次加入10μl標本和90μl預混反應試劑。
(3)加入80-100μl石蠟油,在臺式離心機上快速離心數秒鐘,使各反應試劑收集于油層下。目前,PCR試劑已商品化,反應體積為25μl。使用時只加入標本DNA即可。
4、每次試驗應設陽性及陰性對照。以載有HPV的重組質粒(每反應為100pg)或含有HPV的細胞系(如Caski、HeLa)DNA為陽性對照,以無HPV的人細胞系DNA為陰性對照。
(三)擴增產物的檢測和分析
1、凝膠電泳:擴增反應結束后,取出反應管,冷卻至室溫,取10μl擴增產物用5%-7%聚丙烯酰胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳,溴化乙錠染色,紫外分析儀下分析結果,分子量約為450bp處出現明顯的DNA帶。
2、核酸雜交:如果凝膠電泳無清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時,可用標記的公用混合探針和(或)型特異探針作Southern吸印雜交、斑點雜交驗證。
鑒于PCR技術的高度敏感性,以生殖道脫落細胞為檢材足以滿足試驗要求,避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下,PCR擴增產物經凝膠電泳,觀察產生的DNA可直接作出診斷。因此,PCR技術檢測HPV實驗周期短、簡便快速。