傳統化學合成法是將天冬氨酸轉變為酸酐,然后與苯丙氨酸甲酯縮合成阿斯巴甜。化學法的區域選擇性較差,產生兩種異構體：α-阿斯巴甜和β-阿斯巴甜,α-阿斯巴甜為主產物,β-阿斯巴甜有苦味,必須分離除去,工藝比較復雜。 [5]
嗜熱菌蛋白酶（thermolysin）已成功用于有機相中阿斯巴甜前體的合成,它使苯丙氨酸甲酯與氨基保護的天冬氨酸縮合形成阿斯巴甜前體,再經還原、脫保護基,即可得到阿斯巴甜。酶法催化的反應具有對映體選擇性,只合成α-阿斯巴甜,反應中可以采用外消旋體苯丙氨酸甲酯作為底物,酶催化反應時只利用L-苯丙氨酸甲酯,未反應的D-苯丙氨酸甲酯可形成鹽,酸化后可使之外消旋化而循環利用。