高效液相色譜儀的分離原理主要取決于流動相和固定相對樣品的吸附和解吸，因此流動相的正確配置對實驗數據和分離效果具有重要意義。
一、流動相配置注意事項
通常，溶劑按體積比（v/v）或重量比（w/w）混合。溶液的體積由于溫度而變化，使得流動相按重量比混合，樣品測量的重復性好，但操作復雜，通常在體積混合中。
體積混合有三種方式如50%乙腈水溶液：
方法（1）：用量筒量取500ml乙腈，再量取500ml乙腈。把這兩種液體在瓶子里搖勻。
方法（2）：先將500 ml乙腈放入1L容量瓶中，再用水定容。
方法（3）：取500ml水置1L容量瓶中用乙腈定容。
三種配置都有不同的流動相組成，保留時間不一樣，不考慮其他因素..通常，建議使用方法（1）來配置移動階段。
二、高效液相色譜儀對試劑的要求
試劑（如甲醇和乙腈）必須為色譜級，其他試劑應作為色譜級，試劑標簽用色譜級或HPLC進行標記。水為超純水或水質有保障的純水可直接購買。
三、調節流動相pH值
當弱酸競爭(7)或弱堿(7)通過反相色譜法競爭(8)樣品時，調節流動相的pH值以抑制樣品組分的解離，增加固定相中組分的保留，并且峰形狀技術被改進為反向離子抑制技術。.
（1）對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的K值越大。當pH值遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；在分析弱酸性樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，通常為50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%乙酸鹽溶液。
（2）對于弱堿情況相反在弱堿樣品分析中，流動相中通常加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液在流動相中加入有機胺可以減少堿性溶質與殘留硅醇基團之間的強相互作用減少或消除峰值尾跡現象因此，在這種情況下，有機胺（如三乙胺）也被稱為尾部還原劑或尾部去除劑。
四、含緩沖鹽流動相的配制
在緩沖鹽中使用的鹽試劑也盡可能使用色譜級純度稱重樣品要準確以滿足要求，選擇合適的比例平衡并在日常使用前對天平進行校正按要求配置后必須用0.45μm或0.22μm膜過濾超聲脫氣20分鐘以上,注：應以新形式使用緩沖鹽。