Cas9是CRISPR的手術刀，但有時它會錯誤編輯基因組正常部分，擾亂健康的功能，而不是修復引起疾病的基因。長期以來，科學家擔心這可能會無意中導致健康的細胞變成癌癥，而這些擔憂在今年6月開始加深，當時有兩項研究表明，即使是成功編輯的細胞也容易發生致癌突變。此外，7月在《Nature Biotechnology》上發表的一項研究表明Cas9可能導致無法檢測到的遺傳變化。
CRISPR-Cas9基因編輯系統具有治療疾病的巨大潛力，但是對脫靶效應的擔憂可能會延遲其發展，這促使世界各地的科學家提出了各種改進方法。今年5月，斯坦福大學和國家標準與技術研究所的一個團隊宣布他們發明了一種名為MAGESTIC的新型基因編輯系統，旨在改善編輯DNA的修復過程。今年早些時候，波蘭科學家表示，他們正在完善一種使用Cas9變體切割一條DNA而不是兩條DNA的CRISPR版本。
近日，來自德克薩斯大學奧斯汀分校的科學家們提出，用Cas12a取代Cas9可能是解決現有CRISPR缺點的最佳方法。這項最新研究于8月2日發表在《Molecular Cell》。
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Cas9是CRISPR技術中首次發現和最常用的酶，但眾所周知，它有時不安全地靶向錯誤的基因甚至刪除基因組的部分。而Cas12a不是一個新的發現，其他研究團隊認為它可能比Cas9更精確，但先前的證據尚無定論。
Cas12a：一種比Cas9更精確的酶
Cas9和Cas12a都依賴于20個核苷酸的gRNA來識別靶DNA，在幾個重要方面有所差異，這對研究和治療具有重要意義。
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首先，在其天然形式中，DNA切割酶Cas9與兩種小RNA形成復合物，這兩種小RNA都是切割活性所必需的；Cas12a系統更簡單，因為它只需要一個RNA并且更小，使其更容易進入細胞和組織。
其次，也許最重要的是，Cas12a以不同于Cas9的方式切割DNA。當Cas9復合物切割DNA時，它會在同一個位置切割兩條鏈形成平末端，它們在重新連接時經常發生突變；而對于Cas12a復合物，兩條鏈中的切口是粘性末端，這有望幫助實現精確插入，使研究人員能夠更有效、更準確地整合DNA。
第三，Cas12a遠離識別位點，這意味著即使靶DNA在切割位點發生突變，它仍然可能會被重新切割，從而允許多次機會進行正確的編輯。
第四，Cas12a系統為選擇目標位點提供了新的靈活性。與Cas9一樣，Cas12a復合物必須首先連接到稱為PAM的短序列，并且必須選擇與天然存在的PAM序列相鄰的靶標。Cas12a復合物識別與Cas9不同的PAM序列，這可能是靶向例如瘧疾寄生蟲基因組甚至人類基因組的優勢。
在這些最新的研究中，研究人員證明了Cas12a更加精確并找到了原因，他們發現Cas9在識別gRNA中20個堿基的7或8個堿基后，就開始與其目標DNA結合；而Cas12a在與目標DNA完全結合之前似乎識別了多達18個堿基，這個過程中如果發現不匹配，它會在結合之前脫落。
這一點十分關鍵，因為人體內的DNA在身體周圍循環，這些DNA具有非常相似的堿基，可能導致編輯錯誤的DNA，匹配的堿基越多就意味著有更低的脫靶率、更高的安全性。這也解釋了為什么Cas12a酶在大多數情況下可能比Cas9更安全、更精確。
每種酶都帶有一小段用RNA編寫的遺傳密碼（PAM），它與病毒DNA中編寫的目標遺傳密碼相匹配。當它碰到一些DNA時，酶開始試圖通過形成堿基對來與它結合，從一端開始并沿著它的方向前進，測試每個DNA堿基與RNA的匹配程度。
對于Cas9，每個堿基對緊緊地粘在一起，就像超級膠水一樣。如果每側的前幾個堿基匹配良好，那么Cas9已經與DNA緊密結合。這意味著它很容易忽略過程中的不匹配，導致它編輯錯誤的部分。
對于Cas12a，它更像是一個魔術貼，在沿途的每個點，結合得相對較弱。因此，在整個地帶都需要一個很好的匹配，才能夠長時間地進行編輯。這意味著堿基對形成的過程更加可逆，換句話說，Cas12a可以更好地檢查每個堿基對，然后再轉到下一個堿基對。這使得它更有可能只編輯基因組的預期部分。
本文的研究作者Ilya Finkelstein教授說：“我們的研究為什么不從大自然賦予我們的最佳蛋白質（Cas12a）開始并且進行改進？未來，我們希望改進Cas12a以達到匹配gRNA的20個堿基。”
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Cas12a的切割機制如圖，首先Cas12a上的gRNA能識別靶DNA鏈上的PAM序列，如果它們正確地匹配，就會結合成一種RNA-DNA螺旋（R-環）結構。當完整的R-環形成時，Cas12a酶才結合和切割這條靶DNA。
研究人員發現，Cas12a基本上每個完全結合事件都會導致DNA的切割，因此可以確定必須通過結合動力學來決定Cas12a對錯配的特異性。
為了檢測Cas12a對gRNA和靶DNA之間錯配的特異性，研究人員在R環的每個位置引入了DNA中的單堿基對變化（錯配），測量了Cas12a從這些錯誤的DNA靶標的結合和解離速率。
結果表明，R環內除了一個錯配之外的所有錯配都增加了解離速率。有趣的是，解離率的最大增加是由PAM遠端錯配引起的，除了一個錯配產生3倍（T14C）的較小增加，PAM-遠端錯配使解離速率增加6至80倍。相比之下，PAM-近端錯配增加的Cas12a解離率僅達到5倍。
他們認為，Cas12a-gRNA與靶DNA結合時，Cas12a特異性在R-環形成期間確定，R環的形成具有晚期過渡態，并且它的形成是通過規定的途徑，首先從PAM開始，并且在過渡態中，PAM-近端堿基對用于R-環形成的程度遠大于PAM-遠端堿基對。盡管整個結合過程具有不可逆轉的性質，但這種晚期過渡態允許Cas12a區分錯配，因此解離率增加。
這表明工程化核酸酶可以將過渡態進一步轉移到R-環的PAM-遠端區域，從而擴展基因編輯應用的區域和整體特異性水平。
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動力學分析證明，Cas12a與靶DNA的結合涉及兩個步驟（機制）：
（1）初始步驟代表識別PAM序列，這是快速且可逆的；
（2）接下來，R-環以速率常數rv0.1s-1在PAM附近形成，隨即快速擴大；完全形成R-環后，非靶標鏈（NTS）的裂解快速發生，靶標鏈（TS）的裂解發生緩慢10倍。
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該團隊目前正在一個后續項目中使用這些結果，旨在設計改進的Cas12a。
IlyaFinkelstein教授說：“總的來說，Cas12a更好，但是有些地方Cas12a仍然令人驚訝地對其RNA和基因組靶標之間的錯誤配對視而不見。因此，我們所做的工作是進一步改進Cas12a以建立一個防錯的基因編輯系統。”
新型CRISPR酶助力基因編輯技術
去年，張鋒研究團隊測試了來自15種不同微生物的Cas13a（C2c2酶），最終發現LwaCas13a可比以前的RNA敲低工具（RNAi）更強的特異性在靶RNA上切割特定位點，脫靶效應低。另外，他們還找到了Cas13的“死亡變體”，結合RNA卻不能進行切割作用，并且可通過結合熒光標記來追蹤RNA的軌跡。
《Mol Cell》上的一項研究發現，Cas13b像Cas13a一樣，僅需要單個向導RNA就能找到靶標，并且從遺傳學的角度是可編碼的。此外，Cas13b能夠同時靶向多個RNA轉錄本。但Cas13b的一些特性表明其更適用于微調基因功能。
今年2月，Broad研究所的大牛David Liu通過加速Cas9酶在實驗室中的演化，并不斷累積Cas9的特定突變，帶來了全新的進化版Cas酶——xCas9，比起目前使用最廣泛的spCas9，xCas9在轉錄激活、DNA剪切、單堿基編輯等方面的應用范圍擴大了四倍。同時，xCas9的脫靶效應比spCas9低得多，部分序列的試驗數據僅有原始版的1/100。
3月，Salk研究所的Patrick D. Hsu博士帶領團隊，開發出了一種新的靶向RNA的基因魔剪——CasRx，這是一種來自腸道細菌Ruminococcus flavefaciensXPD3002的Cas13d酶。與靶向RNA的其他技術相比，CasRx是獨特的，因為它尺寸小、有效性高，且與RNA干擾相比，沒有產生明顯的脫靶效應。
結語
CRISPR基因編輯技術給許多遺傳疾病和罕見病帶來了希望，CRISPR系統的進一步完善，安全性的逐步提高是未來必然的方向。Cas9是CRISPR中最常用的酶，這次研究或許能促進對CRISPR使用的酶的機制的闡明以及酶工程的改造。CRISPR技術還有待深入開發，不管是版本還是使用途徑，期待未來科學家能運用得如魚得水，創造更多的可能。