三．主要試驗環節的操作
3.1 酵母菌株的分離純化
接種GS115于5ml YPD液體培養基，30℃，200rpm振蕩過夜，涂布 YPD平板，30℃培養48 小時，用 YNB基本培養基和含His的補充培養基作點種分離純化，挑選在補充培養基生上生長而在基本培養基上不生長的單菌落劃YPD平板，4℃保存。
3.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培養
TOP10F’做為菌種保存在－70 ℃條件下，在進行擴大培養抽提質粒之前，先要進行活化培養。
接種TOP10F’于5ml LLB（加入25ug / ml Zeocin）中，37℃，200 rpm ，培養16～18小時。
3.3畢赤酵母表達的試驗方法
3.3.1 線狀質粒DNA的脫磷酸化處理
為了防止載體質粒DNA的自身環化，用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理酶切后的質粒DNA，具體操作如下：
⑴ 建立反應體系：
線性化的質粒 35ul
10x CIP buffer 4ul
CIP 1ul
ddH2O 5ul
———————————
total 45ul
⑵ 在PCR儀上控制反應溫度（加石蠟油封閉），37℃，15 min ；50℃，15 min；56℃，30 min（滅活）。
⑶ 在56℃未開始前停止，加入proteinse K ，用于滅活CIP，加入試劑如下：
反應物 45ul
10x 5％ SDS 7ul
10x EDTA （pH 8.0） 7ul
proteinse K 5ul
ddH2O 6ul
—————————————
total 70ul
⑷ 純化使用QIAquick spin kit ，按照2.2.3.3步驟進行，20 ul 滅菌ddH2O洗脫純化產物。進行1％瓊脂糖凝膠電泳，120 V， 觀察純化結果，并大約估計DNA濃度。
3.3.2 E.coli TOP10F’ 感受態細胞的制備及轉化
⑴ 取10 ul TOP10F’ 菌液，接種于 200ml LB液體培養基中活化培養，37℃ ，200 rpm，16～18小時。取100 ul菌液接種于 200 ml 液體LB培養基中。
⑵ 37℃ ，200 rpm，培養16～18小時。
⑶ 滅菌500 ml 離心管，4℃，4000 rpm，20 min 。得菌體沉淀。棄上清，菌體用10％甘油重懸并洗滌。重復洗滌3次。
⑷ 第三次離心后，棄絕大部分上清，留下約1ml 液體用于重懸菌體。
⑸ 從制得得感受態細胞中，取200 ul于滅菌EP管中，加入連接反應產物 5ul ，混勻，不要產生氣泡，在冰上放置 5 min。
⑹ 將混勻后得200ul菌液移入電擊杯中。
⑺ 使用電擊穿孔儀進行轉化，設置為 電壓 2500 V，時間 5 ms。
⑻ 電擊后，往電擊杯中加入 800ul SOC培養基，沖洗出菌體，轉移至滅菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，輕搖45～60 min。
⑼ 取全部均勻涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流動，37℃ 培養12～16小時。
*注：設空載體做對照。
3.4 畢赤酵母電轉化方法
3.4.1 菌體的準備：
1. 挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YPD培養基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培養過夜；
2. 取100-500μl的培養物接種至含有500ml新鮮培養基的2L三角搖瓶中，28~30℃、250-300r/min培養過夜，至OD600達到 1.3~1.5；
3. 將細胞培養物于4℃，1500g離心5min，用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；
4. 按步驟3離心，用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；
5. 按步驟3離心，用20ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；
6. 按步驟3離心，用1ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1.5ml；
7. 備注：可將其分裝為80μl一份的包裝冷凍起來，但會影響其轉化效率（2周之內）。
3.4.2 電擊轉化：
8. 將5~20μg的線性化DNA溶解在5~10μl TE溶液中，與80μl的上述步驟6所得的菌體混勻，轉至0.2cm冰預冷的電轉化杯中；
9. 將電轉化杯冰浴5min；
10. 根據電轉化儀提供的資料，參考其他文獻及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數，按優化的參數，進行電擊；
11. 電擊完畢后，加入1ml冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉至1.5ml的EP管中；
12. 將菌體懸液涂布于MD或RDB平板上，每200~600μl涂布一塊平板；
13. 將平板置于30℃培養，直至單個菌落出現。
推薦：電壓 1.5kV；電容25μF；電阻200Ω。電擊時間為4～10msec。