隨著PCR技術的不斷發展成熟（擴增長度、保證性、產量和特異性等），質粒構建過程的大多數細胞內的DNA復制將被PCR這一細胞外的DNA復制所代替，質粒構建效率將有質的飛躍。
4.4密碼子的偏好性的原則
酵母菌對外源基因的表達也和外源基因密碼子的選用有關。了解表達系統宿主在密碼子使用上的偏愛性對從翻譯水平分析外源基因表達的規律有重要意義,也為改造外源基因或改造宿主細胞提供依據［20、21］。
4.5線性化及采用電轉化的原因：
在pPICZαA-EGF電轉整合入GS115的時候，因為需要比較高的轉染率，我們對其用限制性內切酶SacⅠ進行線性化的處理。
細菌內同源重組被認為是重組質粒構建過程的難點。因為未線性化的環狀質粒之間發生同源重組的幾率非常低，所以重組轉移載體必須用特定的限制性內切酶進行線性化處理。這種處理的目的：
⑴ 防止隨機插入重組時質粒在功能區斷開，造成目的基因表達失活；
⑵ 讓同源重組以指定的方式發生。
4.5 乙醇沉淀法的問題
主要步驟如下：
1）酶切體系（80ul）中2倍體積的無水乙醇加1/10體積的PH5.2 NaAC，混勻
2)-20℃ 20分鐘沉淀
3)13200rpm，20min，離心后棄上清
4)75%乙醇300ul輕輕洗，同上離心5min，棄上清
5)37 度烘箱至無乙醇氣味（或是用搖床的出風口吹出的暖風吹）。
6)20ul ddH2O重溶
如果想提高轉化效率，可以稍微做一些改進：
1. 還是用酚抽一下，去除內切酶；
2. 75%乙醇應洗兩遍，盡可能去除鹽離子，防止電轉化杯被擊穿，同時可提高效率；
3. 在沉淀時，如用終濃度2.5M的醋酸鈉+2.5倍體積的無水乙醇，可沉淀幾乎所有的DNA，但需要用75%的乙醇認真的洗兩遍。
4.6 酶切的總結
影響重組質粒構建效率的最關鍵步驟在于酶切，不管是否是定向克隆還是非定向克隆。酶切的關鍵在于切干凈，徹底的酶切反應是成功的一半，特別是載體的酶切，尤其是雙酶切。
雙酶切一般是先反應低鹽buffer的、后反應高鹽buffer的，如果低鹽buffer的酶在高鹽buffer的酶的反應條件下有低活性（一般來講在NEB的手冊上都有標示），最好就先純化（酚/
氯仿抽提、乙醇沉淀）過，再進行第二次酶切反應。注意：有相同功能（如：切同一序列，并產生相同末端）的酶，不一定是相同的酶（結構、性質不同）。
雙酶切失敗有很多原因，先要看你抽的質粒有沒有問題，你可以用2—3種確定單酶切的酶分別切質粒，如果都只有一條帶就沒問題；
再看你的雙酶切的緩沖液是不是合適，如果你的雙酶切條件不對，就會有大小不同的片斷。有時后提供給你的緩沖液的理論值與實際有很大的差別。建議你回頭檢查一下你的質粒超螺旋是不是很好，酶切實在不行的話，就分開來切，順便檢查你的那一個酶，或者那一個酶切有問題。抽提質粒要注意溶液Ⅱ
處理時間不要超過5分鐘，太長會有部分質粒不能復性，而且酶切不動。
酶切反應成功的前提是對質粒載體的大致定量，太多的載體用量對酶切效率有負面影響，而太少的質粒載體不能保證實驗的需要。
4.7線性化及采用電轉化的原因：
在重組質粒電轉整合入酵母的時候，因為需要比較高的轉染率，我們對其用限制性內切酶進行線性化的處理。
細菌內同源重組被認為是重組質粒構建過程的難點。因為未線性化的環狀質粒之間發生同源重組的幾率非常低，所以重組轉移載體必須用特定的限制性內切酶進行線性化處理。這種處理的目的：
⑴ 防止隨機插入重組時質粒在功能區斷開，造成目的基因表達失活；
⑵ 讓同源重組以指定的方式發生。
4.8構建分泌型表達載體的必要性
外源基因表達產物分泌到酵母細胞外，是表達外源基因的一種理想方式。相當一部分有藥理學作用的蛋白質本身就是分泌蛋白質，在分泌過程中通過一系列細胞器，使蛋白質得以加工、修飾、折疊，形成與天然結構更為相似，具有高度生物活性的蛋白質．外源基因若以非分泌形式表達，不通過分泌途徑，必然會失去一些對蛋白質進一步加工和修飾的機會，從而影響產物的空間結構和生物活性［23］。
畢赤酵母自身分泌內源性蛋白很少，誘導培養基皆由小分子物質組成，成分簡單，這為分泌至培養基中的外源基因表達產物純化提供了極大方便，使純化工藝變的簡單易行，有助于提高表達量。
4.9 如何減少PCR反應中的引物二聚體
減少引物形成二聚體的可能性：
1.退火溫度設置不對，導致引物與模板的結合率降低。
2. 引物設計不好，很容易形成二聚體。
如果碰到這種情況，可以嘗試從以下幾個方面解決：
1設計引物的時候
首先要熟悉引物設計的一般的原理，參考一些資料，積累經驗。如果條件允許的話，可以用比較靠得住的引物設計軟件驗證我的引物，如果沒問題，則進行下一步。
2 改變退火溫度
一般引物合成后廠家會提供其Tm值，可以根據這個溫度為基準來做溫度實驗。如果你設計的引物里頭有酶切位點和保護堿基，則此方法不行，可以用比較靠得住的引物設計軟件來計算你引物中與模板結合部分的Tm值，然后以此為基準做溫度實驗。也可以根據自己的實際操作經驗來解決問題。
3最后
建議換一下Taq酶，某些進口的Taq酶太嚴謹，導致引物二聚體的形成，這也是可能的。我們試驗中一直都是使用某國產的Taq酶，效果挺理想。