摘要 通過毛細管微乳液電動色譜10 min內同時分離了安非他明、甲基安非他明、4,5亞甲基二氧基安非他明(MDA)和3甲氧基4,5亞甲基二氧基安非他明(MDMA)4種苯丙胺類毒品及其麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、甲基偽麻黃堿、去甲麻黃堿等麻黃生物堿雜質。比較了毛細管微乳液電動色譜和丁醇改進的膠束電動色譜模式對分離的影響，發現正丁醇是影響分離的最主要因素。本方法具有很好的重復性和穩定性，可實現對冰毒及其麻黃生物堿雜質的快速分析和鑒定，相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別小于1.3%和50%，可用于冰毒的實際來源推斷。
關鍵詞 冰毒，麻黃堿，毛細管微乳液電動色譜，毛細管膠束電動色譜，分離
1 引言
冰毒化學名為苯丙胺或安非他明，它能夠刺激中樞神經系統大量釋放多巴胺，使人達到精神興奮，但長期服用后將使人體產生心律不齊、神經紊亂、精神緊張和幻覺等癥狀。目前非法合成冰毒類毒品主要是由麻黃堿和偽麻黃堿經氯化、氧化和降解而來，并且已經被進一步苯環上取代而發展為作用更強的一系列衍生物，這主要包括甲基安非他明、4,5亞甲基二氧基安非他明(MDA)和3甲氧基4,5亞甲基二氧基安非他明(MDMA)等[1]。到目前為止，冰毒是除海洛因外全球范圍內最泛濫的毒品之一。對冰毒進行成分分析和來源推斷是控制其制毒販毒渠道的有效手段之一。而建立同時分離這些麻黃堿類雜質的分析方法對冰毒類毒品來源推斷是至關重要的 [1，2]。
目前應用于毒品分離分析的技術主要有：色譜技術(薄層色譜、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC))、核磁共振(NMR)技術以及毛細管電泳(CE)技術[1~3]。NMR技術不適合復雜成分的分析，GC和HPLC則不適合對熱不穩定和一些非極性物質的分離。相比而言，CE由于具有獨特的分離機理和多種分離模式，可以適合對毒品中多組分樣品進行分析。
在眾多CE模式中，毛細管膠束電動色譜(MEKC)解決了毛細管區帶電泳無法分離中性物質的問題，從而被認為最適合毒品復雜體系分析的毛細管模式[3]。Tagliaro等 [4]首先使用MEKC模式實現了對包括苯丙胺和甲基苯丙胺20種毒品的分離，但分離時間45 min，不適合實際樣品的分離。只有Wallenborg[5]在CE芯片上通過MEKC模式，在3 min內分離了去甲麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿、安非他明和甲基安非他明。但由于方法特殊性而無法普遍應用于實際冰毒分析。由于麻黃生物堿主要包括麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、甲基偽麻黃堿、去甲麻黃堿和去甲偽麻黃堿6種，它們在麻黃植物中都有一定的含量，而且互為三對同分異構體，因此一般CE方法難以對其分離。到目前為止，還未見到MEKC同時分離上述冰毒類毒品和麻黃生物堿的報道。
近幾年來，微乳液電動色譜(MEEKC)模式成為 CE復雜樣品分離研究的熱點，由于將微乳液體系引入CE作為分離介質，這使得MEEKC模式分離范圍更加廣泛，選擇性更好，分離速率更快，因此，MEEKC將特別適合對毒品復雜體系的分析 [6，7]。研究發現，MEEKC能夠分離O6單乙酰嗎啡和O3單乙酰嗎啡同分異構體，具有很高的分離塔板數[8]。Zhang等[9]用 MEEKCLIF在8min內實現了麻黃堿和假麻黃堿的分離，Zheng等[10]則通過使用手性共表面活性劑的MEKC對麻黃堿、甲基麻黃堿和去甲麻黃堿進行了手性分離。這些研究說明了MEEKC可用于以上所有冰毒類毒品和麻黃生物堿的同時分離。
MEEKC分離機理與MEKC模式相似，但對MEEKC來說，由于共表面活性劑介于油相和水相之間將表面張力減小至零，油滴體積小而且表面張力小，非分析物更容易穿過界面嵌入到膠束內部油滴中，被分析物可更加自由地在水相和油相間出入。這使得MEEKC分離速率更快 [11，12]。而目前MEKC中，通常需要添加甲醇和乙腈等有機溶劑來改進分離的選擇性，由于這些溶劑存在膠束外的水相中，從而大大降低電滲流速度，使得分離時間非常長 [3]，不適合實際毒品的分析鑒定。最近有人[13，14]比較了用正丁醇改進的MEKC的分離情況，發現正丁醇MEKC在分離一些中性化合物時，具有和 MEEKC類似的分離效率，但其對毒品這種復雜樣品的分離情況還不得而知。
因此，本研究探討MEEKC和正丁醇MEKC對苯丙胺類毒品及其麻黃生物堿的分離情況，選用安非他明、甲基安非他明、MDA、MDMA4種冰毒類毒品、以及麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、甲基偽麻黃堿、去甲麻黃堿5種麻黃堿雜質為模型化合物，致力開發一種用于冰毒類毒品CE分析方法，從而為實際冰毒類毒品的鑒定提供強有力的分析工具。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
Beckman MDQ毛細管電泳儀(美國貝克曼儀器公司)，二極管陣列檢測器，檢測波長200 nm，正向分離電壓20 kV，25℃，檢測窗口位于距陰極出口端10 cm處，40 cm×75 μm i.d. 石英毛細管柱(河北永年色譜配件廠)。
安非他明(1)、甲基安非他明(2)、MDA(3)、MDMA(4)標準品(公安部物證鑒定中心)，麻黃堿(5)、偽麻黃堿(6)、甲基麻黃堿(7)、甲基偽麻黃堿(8)、去甲麻黃堿(9)標準品(美國ChromaDex Inc. 公司); SDS純度為98%(Sigma公司); 內標對甲苯胺(IS)和其它試劑均為分析純(北京化學試劑公司)。實驗用水為Millipore QS系統生產的超純水。
2.2 實驗方法
所有標準品及內標對甲苯胺(IS)溶液配制成甲醇溶液，然后用水稀釋至相應的濃度。在所有緩沖溶液中，正辛烷、正丁醇、SDS、硼砂溶液按質量比配制，緩沖溶液總質量保持50g，混合后密閉超聲30min。使用水配制硼砂緩沖液，用1 mol/L NaOH和H3PO4溶液調節緩沖溶液的pH值。緩沖溶液、樣品溶液和沖洗毛細管柱的水、NaOH溶液使用前都經過濾，并超聲3 min脫氣。
新的毛細管使用前用1.0 mol/L NaOH溶液活化30 min，水沖洗20 min，緩沖溶液潤洗3 min。進樣間0.1 mol/L NaOH溶液、水分別沖洗2 min，再用緩沖溶液沖洗2 min。每天實驗完畢先后用水、0.1 mol/L NaOH溶液、水分別沖洗5、10、10 min。
電泳測試步驟：用NaOH溶液、水、緩沖溶液分別沖洗2 min。然后正向壓力0.5 psi進樣5 s，在分離電壓20 kV、25℃下分離10 min。
3 結果與討論
3.1 冰毒的MEEKC法分離
冰毒類毒品和麻黃生物堿結構相近，都屬于苯胺類化合物，屬于弱堿性。對于結構相近的分析物來說，在眾多分離影響因素中，油相種類及濃度變化基本不對分離產生影響，SDS濃度和水相電解質濃度主要對MEEKC分離時間有影響，而調節分離度的能力較弱，影響分離效率最主要因素為pH值和共表面活性劑比例。
3.1.1 pH對MEEKC分離的影響 pH對4種冰毒類毒品和5種麻黃類生物堿MEEKC分離的影響如圖1所示。從圖1可以看到，所有9種被測試物質和內標IS能夠在10 min之內出峰，4種冰毒類毒品達到基線分離，而且幾對麻黃生物堿同分異構體都得到了很好的分離，這證明了MEEKC能快速分離所有冰毒類毒品和麻黃堿雜質。
圖1 不同pH對冰毒類毒品微乳液電動色譜模式分離的影響(略)
Fig.1 Influence of different pH on microemulsion electrokinetic chromatogrpahic (MEEKC) separation
緩沖液體系(buffer system): 十二烷基磺酸納(sodium clodecyl sulfonate, SDS) 3.31%, 正辛烷(noctane) 0.90%, 正丁醇(1butanol) 6.72%, 5 mmol/L 硼砂水溶液(sodium borate solution) 89.07%。峰(peak): 1. 安非他明(amphetamine), 2. 甲基安非他明(methylamphetamine), 3. 4,5亞甲基二氧基安非他明(3,4methylenedioxyamphetamine, MDA), 4. 3甲氧基4,5亞甲基二氧基安非他明(3,4methylanedioxymethylamphetamine, MDMA), 5. 麻黃堿(ephedrine), 6. 偽麻黃堿(pseudoephedrine), 7. 甲基麻黃堿(methylephedrine), 8. 甲基偽麻黃堿(methylpseudoephedrine), 9. 去甲麻黃堿(norephedrine), IS對甲苯胺(ptoluidine)。
從出峰情況來看，5種麻黃生物堿出峰位置在4種冰毒類毒品之前，這是因為麻黃生物堿丙基上多一個羥基，因而負電性較冰毒毒品高，帶微乳液SDS陰離子基團之間的排斥力更大，導致在微乳液內相中分配能力較弱，受到電滲流的推動而出峰在前。另外，9種物質的出峰次序基本不隨pH值改變而改變，表明這9種同類堿性物質堿性差別小，這是因為在考察的pH值范圍內，9種胺類物質質子化受到抑制，正電荷減少而趨向中性，遷移行為主要由物質在兩相中的分配狀況和質量數決定，在不同pH值條件下遷移行為相對穩定。但可以看到，pH的提高是有助于提高5種麻黃生物堿雜質的相對分離度，但彼此之間的分離度降低。如麻黃堿(5)和偽麻黃堿(6)之間、甲基麻黃堿(7)和甲基偽麻黃堿(8)之間相互靠攏，這也從另一方面說明，pH值的提高將減小這些生物堿的帶正電差異，即質子化程度降低而趨近中性。可以預見，當在強堿性時，這些同分異構體將減少差異，從而無法得到分離。 pH的提高也有助于4種冰毒類毒品的分離度。由于MDA和甲基苯丙胺在低pH下有重疊，當pH提高時，苯丙胺和MDA伯胺相互接近，而甲基苯丙胺和 MDMA一級胺相互接近，從而使MDA和甲基苯丙胺的分離度提高。因此，上述結果表明，pH提高將降低同類胺之間的帶電差異，而使同類胺之間的分離效率降低。根據本分離體系的情況，pH為9.5時具有較好的分離效果。
3.1.2 正丁醇對MEEKC分離的影響 圖2是不同正丁醇比例下，9種胺類的分離情況。從圖2可以看出，9種分析物在低正丁醇比例時分離情況更好。隨著正丁醇濃度的增加，分離效率降低，而使所有物質無法達到基線分離。在正丁醇比例為6.02%時，9種冰毒類毒品和麻黃生物堿都得到了基線分離，說明正丁醇濃度低時有更高的分離塔板數。這是因為正丁醇主要存在于微乳液的雙親界面層，使微乳液滴體積增大，表面電荷密度變小，微乳液剛性減小，將表面張力減小至零，油滴體積小而且表面張力小，溶質受到的微乳液SDS靜電作用減小，將能更加自由地進出微乳液，因而微乳液內部油相的作用隨著正丁醇濃度的增加而降低。另外，由于共表面活性劑主要存在于微乳液內部和雙親層里，對電滲流的影響較小。但分析物在微乳液內外交換速度大大增加，使整體分離窗口被擠壓，分離時間逐漸縮短，各溶質出峰時間互相擁擠，從而也使整個分離情況變差。此外，9種胺類分析物出峰順序不受正丁醇比例的影響，這表明9種分析物的分離是主要建立在物質在兩相中的分配系數的差異上，而這時由于 pH穩定，各分析物的荷質比保持相對穩定，從而對出峰順序不產生影響。
圖2 不同正丁醇比例對冰毒類毒品微乳液電動色譜模式分離的影響(略)
Fig.2 Influence of 1butanol on MEEKC separation
緩沖液體系(buffer system): 十二烷基磺酸納(SDS) 3.31%; 正辛烷(noctane) 0.90%; 5 mmol/L硼砂水溶液+正丁醇(1butanol and sodium borate solution) 95.79%, pH 9.5。其它條件同圖1(other conditions were same as those in Fig.1).
3.2 冰毒的正丁醇MEKC法分離
3.2.1 pH對MEKC分離的影響 pH對4種冰毒類毒品和5種麻黃類生物堿正丁醇MEKC分離的影響如圖3所示。從圖3可以看出，9種被測試物質和內標對甲苯胺也能夠在10 min之內出峰，但較MEEKC情況要差一些。從出峰情況來看，基本與MEEKC模式分離相近。由于麻黃生物堿丙基上多個羥基，5種麻黃生物堿出峰位置在 4種冰毒類毒品之前。另外，9種物質的出峰次序基本不隨pH值改變而改變，這也表明這9種同類堿性物質堿性差別小，這是因為在考察的pH值范圍內，9種胺類物質質子化受到抑制，正電荷減少而趨向中性，遷移行為主要由物質在膠束和水相兩相中的分配狀況和質量數決定。但可以看到，9種分析物的正丁醇MEKC模式出峰時間要比MEEKC模式下分離速度快，這是由于膠束內部沒有油相，分析物在膠束內的停留時間縮短，因而出峰時間快。因此，如圖3MEEKC模式，pH提高也有利于分離。根據本分離體系，pH為9.5時具有較好的整體分離效果，9種胺類化合物也都得到了基線分離。
3.2.2 正丁醇對MEKC分離的影響 圖4是不同正丁醇比例下，9種胺類的分離情況。如圖4所示，MEKC模式下使用正丁醇作為有機添加劑時，9種被測試的分析物也能夠在10 min完成分離。但正丁醇MEKC對9種物質的分離效率較MEEKC模式差，各種溶質之間的分離度較差。但隨著正丁醇濃度的增加，分離效率有所提高，尤其對苯丙胺和MDA這對伯胺、以及甲基苯丙胺和MDMA一級胺的分離度明顯改善，原因可能為正丁醇可以進入膠束內部充當油相的作用，從而使得被分析物在膠束和緩沖液分配差異增大。
圖3 不同pH對冰毒類毒品正丁醇膠束電動模式分離的影響(略)
Fig.3 Influence of different pH on 1butanol modified micellar electrokinetic chromatographic (MEKC) separation
緩沖液體系(buffer system): 十二烷基磺酸納(SDS) 3.31%; 正丁醇(1butanol) 6.72%; 5 mmol/L 硼砂水溶液(sodium borate solution) 89.97%.其它條件同圖1(other conditions were same as those in Fig.1)。
圖4 不同正丁醇比例對冰毒類毒品正丁醇膠束電動色譜模式分離的影響(略)
Fig.4 Influence of 1butanol on 1butanol modified MEKC separation
緩沖液體系(buffer system): 十二烷基磺酸鈉(SDS) 3.31%; 5 mmol/L硼砂水溶液 +正丁醇(1butanol and 5 mmol/L sodium borate solution) 96.69%; pH 9.5。其它條件同圖1(other conditions were same as those in Fig.1).
圖5 最佳微乳液電動色譜分離譜圖(略)
Fig.5 Typical MEEKC separation of drug test mixture
緩沖液體系(buffer system): 十二烷基磺酸鈉(SDS) 3.31%; 正辛烷(noctane) 0.90%; 正丁醇(1butanol) 6.02%; 5 mmol/L 硼砂水溶液(sodium borate solution) 89.77%; pH 9.5.其它條件同圖1(other conditions were same as those in Fig.1).
但在高正丁醇比例時，由于正丁醇進入膠束內部而使膠束結構變得非常松散，因而分析物能夠更加快速地進出膠束，使分析窗口大大壓縮，反而使得整個分離度變差。結果表明，MEEKC模式中膠束內油相的存在對提高膠束粒子的分離效率非常關鍵，使得MEEKC具有比相類似的正丁醇MEKC具有更高的分離效率。但在正丁醇高濃度下，這兩種模式的分離情況相似，也說明由于正丁醇進入膠束內部，使得MEEKC中油相的作用被掩蓋。總之，在pH為9.5、正丁醇為6.72%時，正丁醇MEKC對9種被測試冰毒毒品及其麻黃堿雜質分離情況最好，基本達到了基線分離。
3.3 冰毒和麻黃生物堿最佳MEEKC分離條件
綜上所述，9種冰毒類毒品和麻黃生物堿的最佳分離模式為MEEKC，其分離條件為：SDS 3.31%，正辛烷0.90%，正丁醇6.02%，5mmol/L硼砂水溶液89.77%，pH 9.5。在最佳條件下，9種模型化合物分離譜圖如圖5所示。由圖5可見，9種冰毒類毒品及相關化合物基本都得到了基線分離。
在MEEKC最佳分離條件下，對9種毒品和內標對甲苯胺的混合溶液重復進樣5次，計算相對遷移時間和相對峰面積的RSD。結果見表1。由表1可知，各峰的相對保留時間的RSD均<1.3%;相對峰面積的RSD均<5%，表明方法的重復性良好，該方法有很好的穩定性。
表1 微乳液電動色譜方法分離9種冰毒類毒品成分的重復性實驗結果(略)
Table 1 Repeatability test results of MEEKC separation for 9 test drugs
4 結論
選擇4種主要冰毒類毒品和可能出現的5種麻黃類生物堿，實現了9種冰毒類MEEKC模式的快速分離。分離在10 min內完成，其中幾對麻黃生物堿同分異構體亦得到了很好的分離。以對甲苯胺為內標，方法重復性和穩定性良好，可應用于冰毒類毒品的快速鑒定、成分定性定量分析。
還研究了MEEKC和正丁醇MEKC2種模式對其分離的影響，發現正丁醇MEKC模式亦可以實現9種冰毒類的分離，其中幾對麻黃生物堿同分異構體亦得到了很好的分離。和MEEKC分離的對比研究，揭示了微乳液中油相的存在是MEEKC具有更高分離效率的關鍵控制因素，同時亦進一步證明了共表面活性劑比例的增加將使共表面活性劑改進的MEKC的分離效率趨勢同于MEEKC。此外，還發現pH是調節這兩種模式總體分離度的有效控制因素。
References
1 Institute of Forensic Science(公安部第二研究所). Lab Handbook for Stupefacient: UN Detection Method for Stupefacient and Pneuma Drugs(麻醉藥品實驗室使用手冊：聯合國推薦的麻醉藥品及精神藥品檢測方法)， 1996
2 Dams R, Benijts T, Lambert W E, Massart D L, de Leenheer A P. Forensic Science International, 2001, 123: 81~88
3 Lurie I S. Journal of Chromatography A, 1997, 780: 265~284
4 Tagliaro F, Smith F P, Turrina S, Equisetto V, Marigo M. J. Chromatogr. A, 1996, 735: 227~235
5 Wallenborg S R, Lurie I S, Arnold D W, Balley C G. Electrophoresis, 2000, 21: 3257~3263
6 Altria K D. J. Chromatogr. A, 1999, 844: 371~386
7 Altria K D, Mahuzier P E, Clark B J. Electrophoresis, 2003, 24: 315~324
8 Wen T, Zhao X, Luo G A, Wang J, Wang Y M, Li P, Zhu J, Yu Z S. Chinese Chemical Letter, 2005, 16(11): 1499~1502
9 Zhang J Y, Xie J P, Liu J N, Tian J N, Chen X G, Hu Z D. Electrophoresis, 2004, 25: 74~79
10 Zheng Z X, Lin J M, Chan W H, Lee A W M, Huie C W. Electrophoresis, 2004, 25: 3263~3269
11 Pomponio R, Gotti R, Luppi B, Carvrini V. Electrophoresis, 2003, 24:1658~1667
12 GabelJensen C, Hansen S H, PedersenBjergaard S. Electrophoresis, 2001, 22: 1330~1336
13 Hansen S H, GabelJensen C, PedersenBjergaard S. J. Sep. Sci., 2001, 24: 643~650
14 Lucangioli S E, Cardurri C N C, Scioscia S L, Carlucci A, Bregni C, Kenndler E. Electrophoresis, 2003, 24: 984~991
本文系國家科技部十五攻關(No.2001DA801B04)和國家863(No.2002AA2Z2004)基金資助項目
(清華大學化學系，北京 100084)
(北京市公安局法醫檢驗檢測中心，北京 100085)
(公安部科技局，北京 100741)
(公安部物證鑒定中心，北京100038)