毛細管電泳展望（一）

一, 毛細管電泳的興起與發展

毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE),又稱高效毛細管電泳(HPCE)是近年來發展最快的分析化學研究領域之一.1981年Jorgenson等[1]在75μm內徑的毛細管內用高電壓進行分離,創立了現代毛細管電泳.1984年Terabe等[2]發展了毛細管膠束電動色譜(MECC).1987年比Hjerten[3]建立了毛細管等電聚焦(CIEF),Cohen和Karger[4]提出了毛細管凝膠電泳(CGF).1988—1989年出現了第一批CE商品儀器,1989年第一屆國際毛細管電泳會議召開,標志了一門新的分支學科的產生.短短的幾年內,由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學各領域中對生物大分子(肽,蛋白,DNA等)的高度分離分析的要求,得到了迅速發展,正逐步成為生命科學及其它學科實驗室中一種常用的分析手段.近三年來國際毛細管電泳會議與會者均達700—800人,1996,1997兩年公開發表的有關CE論文達3600余篇.可參見相關綜述則[5-8].歐洲,美國國內及日本也相繼召開CE地區性國際會議.我國在CE領域研究起步早,發展快,研究工作較全面,有的研究成果達到國際先進水平.定期召開全國CE會議及亞太地區國際會議,在國際上已有一定的影響.1984年中國科學院化學所竺安教授在國內率先開展CE研究,迄今國內已有幾百個單位開展CE研究和應用.從CE理論到各種模式及各方面應用,國內均在進行.1998年舉行的第三屆全國CE會議共收錄論文129篇,同時舉行的第二屆亞太國際會議也取得了成功.毛細管電色譜(CEC),CE/MS聯用,低背景毛細管梯度凝膠電泳,手性藥物分離,逆流聚焦及脫氧核糖核酸(DNA)各種CE測定方法等一批研究成果均達到國際先進水平.

二, 毛細管電泳基本原理

CE是以高壓電場為驅動力.以毛細管為分離通道,依據樣品中各組成之間淌度和分配行為上的差異,而實現分離的一類液相分離技術.儀器裝置包括高壓電源,毛細管,柱上檢測器和供毛細管兩端插入又和電源相連的兩個緩沖液貯瓶,在電解質溶液中,帶電粒子在電場作用下,以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現象稱電泳.CE所用的石英毛細管在PH>3時,其內液面帶負電,和溶液接觸形成一雙電層.在高電壓作用下,雙電層中的水合陽離子層引起溶液在毛細管內整體向負極流動,形成電滲液.帶電粒子在毛細管內電解質溶液中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)二者的矢量和.帶正電荷粒子最先流出;中性粒子的電泳速度為"零",故其遷移速度相當于EOF速度;帶負電荷粒子運動方向與EOF方向相反,因EOF速度一般大于電泳速度,故它將在中性粒子之后流出;各種粒子因遷移速度不同而實現分離,這就是毛細管區帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE)的分離原理.CZE的遷移時間t可用下式表示:

式中,μep為電泳淌度,μen為電滲淌度,V為外加電壓,ιt為毛細管總長度,ιd為進樣到檢測器間毛紉管長度.理論塔板數N為:

式中,D為擴散系數.分離度R為<BR>式中,μ1,μ2分別為二溶質的電泳淌度,μep為二溶質的平均電泳淌度.

從式(11.2)可看出,CE的N是和溶質的擴散系數D成反比,而高效液相色譜 (HPLC)的N和D成正比,因此擴散系數小的生物大分子,CE的柱效比HPLC高得多.CE比HPLC有更高的分離能力,主要由兩個因素決定:一是CE在進樣端和檢測時均沒有像HP比的死體積;二是CE用電滲流作推動流體前進的驅動力,整個流體呈扁平型的塞式流,使溶質區帶在毛細管內不易擴散,而HPLC用壓力驅動使柱中流體呈拋物線型,導致溶質區帶擴散,使校效下降。

CE將經典電泳技術和現代微柱分離有機地結合,取得了比HPLC和平板凝膠電泳更多的優點.概括起來可謂三高二少一廣.高質量靈敏度:常用紫外檢測器檢測限可達10-13一10-15mol,激光誘導熒光檢測器(LIF)則達10-19一10-21mol.高分辨率:每米理論塔板數為幾十萬,高者可達幾百萬乃至幾千萬.高速度:許多分析可在幾十秒內完成.所需樣品少:只需納升(10-9)的進樣量.成本低:只需少量的流動相和低廉的毛細管.應用范圍廣;除分離生物大分子外,還可用于小分了(氨基酸,藥物等)及離子(無機及有機離子).甚至可分離各種顆粒(如細胞,硅膠顆粒等).

CE發展迅速也得力于大批色譜工作者轉向CE,在理論上提出了各種模型,如解釋CZE中區帶擴展及理論塔板高度模型,熱影響模型,遷移速率和分離度模型等等[9-10].近年來基礎研究集中于解決CE應用中一些關鍵性問題.如EOF對分離,定量影響極大,故研究了測弱EOF的方法,陽離于存在下的EOF,還有在兩個中性標記物之間夾一個緩沖液塞的三明治式方法測定EOF [11].EOF測定將解決CE定量問題.電泳淌度定量計算也在發展,如用金屬陽離子的一些結構參數,定量得出結構—保留(電泳)間的關系(QSRR) [12]及計算手性化合物淌度的軟件等.特別是各種優化方法用于優化CZE,MECC,CEC及手性分離的實驗參數,如重疊分離譜(OBM),多變量統計設計及Plackett-Buman多變量實驗設計[13]等.

三, 毛細管電泳分離模式

按毛細管內分離介質和分離原理的不同,CE現有六種分離模式,分述如后.

1. 毛細管區帶電泳(CZE)
       CZE分離機理是基于各被分離物質的凈電荷與其質量比(荷質比)間的差異.迄今CZE仍是應用最多的模式,應用范圍包括氨基酸,肽,蛋白,離子,對映體拆分和很多其它帶電物質的分離.CZE常用介質為電解質水溶液,根據情況可加入不同有機溶劑或其它添加劑.還有一種非水CE,如在乙腈中加入嗡 鹽(tropyltum)來分離多環芳烴化合物,現在發展到可不加支持電解質,直接用乙腈,甲酰胺,甲醇等作溶劑來進行非水CE[14].

2.