毛細管電泳展望（二）

毛細管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis,CGE)

CGE是將平板電泳的凝膠移到毛細管中作支持物進行電泳,不同體積的溶質分子在起"分子篩"作用的凝膠中得以分離.常用于蛋白質,寡聚核苷酸,核糖核酸(RNA),DNA片段分離和測序及聚合酶鏈反應(PCR)產物分析.CGE能達到CE中最高的柱效.為了解決人類基因組計劃的關鍵,即DNA測序的速度,已試制出96支毛細管陣列的DNA測序儀,并已有8支毛細管陣列的DNA測序商品儀器.凝膠的制備和不同模式令人關注,最近發展出—種低背景毛細管梯度凝膠電泳[15],在測定糖,寡聚核苷酸及人工模擬蛋白方面取得進展.還有報道采用親和凝膠電泳來識別和鑒定基于DNA藥物的結合蛋白等.

3. 毛細管膠束電動色譜(mfcellar electrokinetic capillary chromatography, MECC)

采用表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉,SDS)在運動緩沖液內形成一疏水內核,外部帶負電的動態膠束相,利用溶質具有不同的疏水性,因而在水相和膠束相(準面定相)間分配的差異進行分離,既能分離中性溶質又能分離帶電組分的CE模式.MECC拓寬了CE的應用范圍,主要用于小分子,中性化合物,手性對映體和藥物等.常用表面活性劑有各種陰離子表面活性刑,陽離子表面活性劑,非離子和兩性表面活性劑.也有用混合膠束,如陰離子表面活性劑和膽酸鹽組合混合膠束.有報道采用脂肪醇的微乳液膠束電動色譜(MEEKC)有比MECC更高的柱效,更快的分析速度和容易控制"窗口" [16].我們也成功地用MEEKC同時分離測定酸性和堿性蛋白.

4. 毛細管等電聚焦(capillary isoelelectric focusing,CIEF)<BR>用兩性電解質在毛細管內建立pH梯度,使各種具有不同等電點的蛋白質在電場作用下遷移到等電點的位置,形成窄的聚焦區帶.已成功地用于測定蛋白質等電點,分離<BR>異構體等.如用CZE和CIEF研究制備過程中糖蛋白不同糖基化程度引起的非均一性,<BR>結果表明CIEF方法要比CZE的好[17].

5. 毛細管等速電泳(capillary isotachophoresis,CTTP)<BR>采用先導電解質和尾隨電解質.使溶質按其電泳淌度不同得    以分離,是一種較老的方式.現在常用作柱前濃縮方法用以富集樣品,以解決CE測定中濃度靈敏度不如服比的問題,如HPLC的問題,如在線ITP—CZE即是成功的模式[18].

6. 毛細管電色譜(capillary electrochromatography,CEC)

將HPLC中眾多的固定相微粒填充到毛細管中(或涂漬到管壁).以樣品與固定相之間的相互作用為分離機制,以電滲流為流動相驅動力的色譜過程稱為CEC[19-20]. CEC將CE的高效和HPLC的高選擇性相結合,得到了CE研究者的青睞.90年代初解決了毛細管填充技術后,CEC發展迅速,HPCE'97會議上已達35篇論文,HPCE'98又創54篇之多.CEC可分為開管CEC(即管壁涂漬固定相)和填充CEC.我國學者在CEC方面作了大量研究工作,對CEC的理論,反相電色譜,正相電色譜,離子交換電色譜及電色譜手性分離等模式均作了較系統研究[21-23],連續兩年在國際CE會上作大會報告,目前已在ODS,硅膠,氰基,胺基,陰,陽離子交換樹脂等10余種填料CEC柱上進行研究,開管CEC也發展了一些新技術,如硅膠—溶膠法在管壁涂漬C8固定相[24],分子印刷法分離手性化合物[25].

以上六種模式為CE基本模式,此外如親和,免疫毛細管電泳發展趨勢亦較好.

四,毛細管電泳柱技術

毛細管是CE的核心部件之一.早期研究集中在毛細管直徑,長度,形狀和材料方面,目前集中在管壁的改性和各種柱的制備.

1. 動態修飾毛細管內壁

管壁改性主要是消除吸附和控制電滲流,通常采用動態修飾和表面涂層兩類方法.動態修飾采用在運行緩沖液中加入添加劑,如加入陽離子表面活性劑十四烷基三甲基溴化銨(TTAB),能在內壁形成物理吸附層,使EOF反向.添加劑還有聚胺,聚乙烯亞胺(PEI)等,甲基纖維素(MC)可形成一中性親水性覆蓋層.

2. 毛細管內壁表面涂層

涂層方法有很多種,包括物理涂布,化學鍵合及交聯等 最常用的方法是采用雙官能團的偶聯劑,如各種有機硅烷,第一個官能團(如甲氧基)與管壁上的游離羥基進行反應,使其與管壁進行共價結合,再用第二個官能團(如乙烯基)與涂漬物(如聚丙烯酰胺)進行反應,形成一穩定的涂層.此外還有將纖維素,PEI和聚醚組成多層涂層,親水性的絨毛涂層(fuzzy)和聯鎖聚醚涂層[6].

3. 凝膠柱和無膠篩分

CGE的關鍵是毛細管凝膠柱的制備,常用聚丙烯酰胺凝膠栓來進行DNA片段分析和測序.測定蛋白質和肽的分子量常用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-LPAGE).如將聚丙烯配胺單體溶液中的交聯劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)濃度降為零,得到線性非交聯的親水性聚合物用作操作溶液,仍有按分子大小分離的作用,稱無膠篩分.此法簡單,使用方便,分離能力比CGE差.

4. 毛細曾填充往等

CEC填充柱已在前面論述.也有將核糖核酸酶,己糖激酶,腺苷脫氨酶等固定到毛細管表面,構成一開管反應器,再和CE連接,可進行核酸選擇性檢測,微量在線合成和分離寡核昔酸等工作.另一有意義的工作是用各種方式在毛細管內緩沖液中形成各種梯度,如PH梯度,溶劑濃度梯度等,來提高分離效率和選擇性.

五, 毛細管電泳檢測技術

CE對檢測器靈敏度要求相當高,故檢測是CE中的關鍵問題.迄今為止除了原子吸收光譜與紅外光譜末用于CE外,其它檢測手段均已用于CE.現選擇重要的幾類檢測器介紹其最新進展.

1. 紫外檢測器(UV)

UV檢測器集中在提高靈敏度,如采用平面積分檢測池,這種設計可使檢測光路增加到1cm[26].也有用光散射二極管(LEDS)作光源,其線性范圍和信噪比優于汞燈.總體來說進展不大.

2. 激光誘導熒光檢測

LIF是CE最靈敏的檢測器之一,極大地拓展了CE的應用,DNA測序就須用LIF,單細胞和單分子檢測也離不開LIF.LIF不但提高了靈敏度,也可增加選擇性,缺點在于被測物須用熒光試劑標記成染色.利用CE-LIF技術可檢出染色的單個DNA分子,向癌癥的早期診斷及臨床酶和免疫學檢測等方向進行.CE/LIF向三個方向發展:在原有氦—鎘激光器(325nm)和氬離子激光器(488nm)之外,發展價廉,長波長的二極管激光器;發展更多的熒光標記試劑來擴展應用面;開展更多的應用研究.CE/I'IF和微透析結合可測定腦中神經肽.采用波長分辨熒光檢測器可提供有關蛋白和DNA序列的一些結構和動態信息[27].一些適用于二極管激光器的熒光標記試劑如CY—5等,正在不斷開發和應用.

3. CE/MS聯用

將現在最有力的分離手段CE和能提供組分結構信息的質譜聯用,彌補了CE定性鑒定的不足,故發展特別快.CE/MS聯用主要在兩方面發展:一是各種CE模式和MS聯用,二是CE和各種MS聯用.關鍵是解決接口裝置.成功地應用到CE/MS接口中.