蛋白質是一種兩性電解質分子，當它在大于其等電點的pH環境中時，會解離成帶負電的離子，在電場中向正極泳動；當它在小于其等電點的pH環境中時，會解離成帶正電荷的離子，在電場中向負極泳動。這種泳動作用到達它的等電點的pH環境中，即它的凈電荷為零時才會停止，此時蛋白質在電場作用下的遷移運動與擴散運動達到平衡。如果在毛細管等電聚焦電泳色譜儀的pH梯度環境中進行蛋白質的電泳，由于各種蛋白質的等電點不同，就能把不同蛋白質分子按等電點集中和分離在不同的區帶中。 在毛細管等電聚焦電泳色譜儀的蛋白質等電聚焦過程中，分離僅僅決定于蛋白質的等電點，這是一個穩定過程，一旦蛋白質到達它的等電點位置，失去凈電荷，就不能進一步遷移而停留在與此蛋白質pI相同的pH值位置。等電聚焦的zui大優點是具有濃縮效應（聚焦效應），可對抗擴散，產生窄而穩定的蛋白質區帶。在毛細管等電聚焦電泳色譜儀中，電極之間的pH梯度是線性和連續的，蛋白質即使會擴散，如果蛋白質區帶向陰極擴散，則進入高pH范圍而帶負電荷，陽極會將它吸回去，直到它回到凈電荷為零的位置。如果蛋白質區帶向陽極擴散，則進入低pH范圍而帶正電荷，陰極會將它吸回到凈電荷為零的位置。因此，蛋白質只能在它的等電點位置被聚焦成一條窄而穩定的區帶。
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