氣相色譜（FID）溶劑峰峰高很低

恢復一根已受污染的高效液相色譜柱的關鍵在于了解污染物的性質，然后尋找一種合適的溶劑將其去除。如果污染物是由于一些強保留物質的多次進樣積聚而產生，一個除去這些污染物的簡單的沖洗過程往往會使色譜柱恢復性能。有時，在經過了等度操作之后，用20個柱體積的90％～100％的溶劑B（二元反相體系中較強的溶劑）將會除去這些污染物。（表二列出了各種型號的高效液相色譜柱的柱體積，所以讀者可以很輕易地確定色譜柱的沖洗體積。）例如，脂質類的化合物可以使用一些非水性的溶劑來去除，如甲醇、乙睛、四氫呋喃。如果你正在使用含水的緩沖流動相，則千萬不能將流動相直接跳到強溶劑中。將流動相猛然間改到高比例有機相的舉動會導致高效液相色譜流動體系的緩沖沉淀，這將會造成更加嚴重的問題，如使篩板堵塞，接口管路堵塞，泵的密封墊失效，刮傷泵的柱塞桿，使進樣閥轉子失靈。相反，應使用非緩沖的流動相來沖洗色譜柱（就是用水來代替緩沖液）。在經過了5～10個柱體積的非緩沖溶劑沖洗之后才能允許較強的溶劑流經色譜柱。
有時，流動相中的強溶劑組分是不能充分去除色譜柱中的污染物的。必須另外使用一種更強的溶劑或一系列的溶劑才能清洗色譜柱。假如污染物是非生物性的，則使用者可以通過一種或更多的其他有機溶劑來去除不需要的化合物。可以使用許多種的溶劑和溶劑組合方式。訪問一些色譜柱生產廠商的網站可以瀏覽到一些推薦使用的溶劑系統。
一般來說，所有的清洗都會遵循一個相似的模式。清洗過程中的溶劑濃度是增加的，通常最后都是使用一些非極性的溶劑（例如：乙酸乙酯，乃至碳氫化合物），它將會有助于溶解一些脂質類和油類化合物。重要的是要確保這一系列的每個溶劑都能與所使用的下一個溶劑互溶。一個清洗循環的結論是，在回到初始的流動相系統之前，可通過中間的可互溶的溶劑反向走。例如，異丙醇就是這個中間步驟的一個極好的溶劑，因為它能夠同有機溶劑互溶，如正己烷和二氯甲烷，而且同樣也能夠和水相溶劑互溶。因為異丙醇有很大的粘度，所以必須確保清洗時流速不能太高，否則會引起泵的壓力過載。同樣，如果使用了紫外檢測器，則需避免使用在紫外光譜區有吸收的溶劑，因為這樣會需要大量的清洗溶劑才能去除所有吸收的溶劑以得到一個穩定的基線。對于典型的鍵合硅色譜柱和無緩沖液的流動相的一個推薦使用的清洗系統就是：
l 100％甲醇；
l 100％乙睛；
l 75％乙睛——25％異丙醇；
l 100％異丙醇；
l 100％二氯甲烷；
l 100％正己烷；

當使用了二氯甲烷或正己烷作為沖洗溶劑后，由于溶劑的不互溶性，需要先用異丙醇沖洗色譜柱，而后才能使用含水的流動相。沖洗色譜柱的清洗溶劑的體積最小為柱體積的十倍。對于一根250mm×4.6mm的色譜柱，分析者可以使用經典的1～2mL/min的高效液相色譜流量。為了要回到原來的流動相，色譜工作者可以跳過顛倒使用該系列的清洗溶劑。推薦使用異丙醇為中間的清洗溶劑，然后用不含緩沖液的流動相沖洗，最后再用最初使用的流動相進行沖洗。四氫呋喃是另一個使用廣泛的溶劑，它可以被用來清洗受污染的色譜柱。如果使用者懷疑色譜柱受到了比較嚴重的污染，則可以用二甲亞砜或二甲基甲酰胺與水以50：50的比例，以小于0.5mL/min的流速進行清洗。成功的反向液相色譜柱的再生需要花費相當多的時間，使用溶劑進行沖洗可以設置梯度程序來進行通宵操作。*
在清洗過程中產生了是否應該將色譜柱顛倒過來沖洗的問題。因為大部分的強保留的污染物都會留在色譜柱的前端，將色譜柱顛倒過來清洗會減少已被溶解的污染物流出色譜柱的遷移距離。就填料層的穩定性而言，大部分的現代高效液相色譜柱都是用比普通操作壓要高得多的壓力裝填的；因此，色譜柱的填料層應該不會受到反向的流速的干擾。然而，如果色譜柱頂端的篩板的空隙要比底部的來得大，這種反向的方式則是有害的。比如說，如果底部篩板的空隙為2μm，則足夠容納裝填有平均填料粒徑為5μm的色譜柱。（含有粒徑5±2μm的尺寸分布）。然而生產商往往在色譜柱的頂端安裝空隙度比較大的篩板，以防止其被樣品或流動相顆粒所堵塞。如果這種篩板的空隙度要比粒徑大小分布的最小微粒大，部分填料會經篩板而流出色譜柱，這樣就會產生中空。如果色譜柱上有一個箭頭來提醒色譜柱的流向，我覺得應該在反向使用色譜柱之前參考說明使用書，瀏覽生產商的網站，或與技術支持組進行商討，以確定這是否是一個安全的舉動。無論你是否將色譜柱反向使用，最好要將色譜柱同高效液相色譜檢測器斷開，使污染物或者顆粒留在篩板上而不流經檢測池，因為這些物質會污染檢測池。
清洗污染的反相色譜柱的頻率依懶于有多少不明物質被注射到柱子中，因為反相色譜柱有時在分辨率損失和外來物質的洗脫前可以忍受大量的污染物, 使用者往往等到他們觀察到一些異常現象才對柱子進行清洗。然而，長時間累積的污染物會使色譜柱的清洗工作變得更難。正因為如此，如果你知道自己的色譜柱很容易受到臟的樣品基體的污染時，我建議定期清洗你的色譜柱。清洗的次數越多，清洗條件也就越簡單。

反相硅膠基質色譜柱中殘留蛋白質的清洗

如果一些如血漿、血清的生物物質留在了反相液相色譜柱上，色譜工作者必須使用一些不同的清洗程序。在大部分情況下，一些比較純的有機試劑如乙睛或甲醇是不能溶解肽和蛋白質的，所以它們不能有效清洗反相液相色譜柱。然而加入了緩沖液、酸或者一些離子對試劑的混合有機溶劑能夠有效清洗這些物質。起初，可以嘗試含比較高濃度的溶劑B的流動相來沖洗色譜柱。
Freiser和他的同事（4）發現來回反復地梯度洗脫，使用三氟乙酸的水溶液和三氟乙酸—正丁醇可以使污染的反相液相色譜柱再生。Bhadway和Day（5）建議進樣100μL的三氟乙醇到250mm×4.6mm色譜柱可以達到清洗的目的。如果這些方案都失敗了的話，推薦使用Cunico和他的同事們（6）的強洗脫液和溶解性的試劑（見表三）。然而，在用這些試劑沖洗色譜柱之前，應該參考色譜柱的手冊，或和生產商進行商議，以確保其不會破壞色譜柱的填料。硅鍵合色譜柱的填料往往能夠與這些試劑共存，而聚合物色譜柱可能會因為與特定溶劑結合而使填料產生膨脹或收縮，從而影響到色譜柱的性能。

表三 用于HPLC反相色譜柱蛋白質物質除去的清洗溶劑
溶劑 組成
乙酸 1%的水溶液
三氟乙酸 1%的水溶液
0.1%三氟乙酸-異丙醇 40：60（V：V）（粘稠的，通常降低流速）
TEA-異丙醇 40：60（V：V）（在三乙胺混合前用0.25N的磷酸調節pH到2.5）
尿素或胍的水溶液 5-8M（調節pH到6-8）
NaCl，Na3PO4，Na2SO4水溶液 0.5-1.0M (Na3PO4 pH 7.0)
DMSO-水 或 DMF-水 50：50（V：V）
來自參考文獻6。

如果使用了早期的一系列溶劑，則必須確保表三中的溶劑與這個系列中的溶劑都是互溶的。異丙醇是一個良好的中間沖洗溶劑。在體系中的清洗體積最少為20個柱體積。由于一些溶劑清洗系統具有一定的粘滯性，所以必須調整沖洗流速以避免產生超壓。在清洗完一根含有胍和尿素的色譜柱后，需要用至少40～50柱體積的色譜級的水進行沖洗。
對于反相高效液相色譜柱來說使用一些如十二烷基磺酸鈉（SDS）和Triton的清洗劑來清洗是不妥的，因為這些化合物會強烈地吸附在硅膠基質的表面而難以去除。這些試劑會影響填料表層，改變填料的性質。然而，分離小組的研究發現，肽合成過程中保護基團和凈化劑產物對柱子的污染，可以通過在流動相中注射500μL的1％SDS溶液以1mL/min的流速進行沖洗（7）。如果接下來使用含0.1％(V/V)三氟乙酸的5％～95％乙睛的梯度，在開始的條件下進行平衡，多肽的分離效果則可恢復。