（4）濾紙：
層析濾紙由高純度棉花制成，要求濾紙要清潔，質地均一，厚薄一致，纖維松緊度適中，具有一定的機械強度，要被溶劑所飽和。
不同型號的濾紙，其厚薄程度、纖維松緊度各不相同，因此，濾紙纖維結合水的量不一樣，兩相的體積比也就不同，Rf也不同；
另外，濾紙的雜質也會影響Rf，必要時進行預處理（可用0.01～0.4M的HCl處理除去金屬離子）；
（5）室驗室的溫度和時間:
溫度影響物質在兩相中的溶解度，即影響分配系數；也影響濾紙纖維的水合作用，影響固定相的體積；也顯著地影響溶劑系統的含水量，即影響流動相的組分比例，層析必須在恒溫條件下進行，某些對溫度敏感的溶劑系統，最好不配制成飽和溶液。層析時間長Rf大。
（6）展開方式：
下行法（層析缸上部有一盛展開劑的液槽,濾紙點樣端向上進入槽中，重現性差，斑點易擴散）Rf大，上行法Rf小；環行法（最好用無方向性的特制濾紙）用圓形濾紙層析時，由于內圈較外圈小，限制了溶劑的流動，Rf較小。
（7）樣品溶液中雜質：
如氯化鈉的存在會影響氨基酸的Rf值。
三、實驗材料、儀器和試劑：
1、實驗材料：谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸標準品
2、儀器：(1)毛細管(2)電熱吹風機(3)層析缸(4)層析濾紙
（5）小型玻璃噴霧器（6）鉛筆、直尺等。
3、試劑：
（1）氨基酸標準溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、組氨
酸標準品。
（2）溶劑系統：
正丁醇：甲酸：水=15：3：2（體積比）搖勻；
（3）0.25%的水合茚三酮溶液。
四、實驗步驟：
1、樣品的準備：稱取谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸標準品各1mg混合溶于10%異丙醇中。
2、濾紙的準備：取一長方形濾紙，在濾紙縱向對應的兩邊距邊沿2cm處，各畫兩條平行線，一條作前沿標志，一條作點樣線，在點線上每隔2cm畫一個“+”作為點樣位置，共5個點。
3、點樣：用毛細管點樣，中間的點混合氨基酸，兩側點四種標準氨基酸；每個點樣點重復點5次，每點一次用電吹風吹干后再點下次（此時，用冷風吹干，防止氨基酸變性降解），點樣點的直徑應控制在2mm左右，點樣完畢用大頭針將濾紙做成筒形，點樣面向外,注意紙的兩邊不要接觸。
4、展層：
向層析缸中加入層析溶劑，液層不要超過點樣線，（高約1.5cm，約50－60ml溶劑）將濾紙點樣點朝下放入層析溶劑中，將層析缸密閉，待溶劑到達標志線后取出，冷風吹干。
5、顯色：
用噴霧器將0.25％茚三酮顯色劑均勻噴在濾紙上，熱風（加快反應）反應吹干顯色。
五、實驗結果與計算： 五、實驗結果與計算：
1、用鉛筆將層析色譜輪廓和中心點描出來；
2、測量原點至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計算各種氨基酸色譜的Rf值。
3、分析混合樣品中未知氨基酸的組分。