氨基酸序列測定實驗

分離膠和積層膠溶液 還原型谷胱甘肽干粉

4 × 凝膠緩沖液 10 × 下槽緩沖液 10 × 上槽緩沖液 甲醇 轉移緩沖液 0.1%（V／V）考馬斯亮藍的 50％甲醇溶液 10％（V／V）乙酸的 50％甲醇溶液

微量注射器或凝膠加樣吸頭 PVDF 膜 小型電轉裝置 自動蛋白質測序儀

1. 如蛋白質電泳實驗中所述，以分離膠和積層膠溶液灌制變性微型凝膠。在加入過硫酸銨和 TEMED 之前脫氣，小心不要在轉移或吸取液體時把空氣帶入聚合混合物中。如果加樣孔不是矩形和結實的，則需重新灌制。

2. 組裝垂直凝膠電泳裝置。

3. 將 80 ml 4 × 凝膠緩沖液稀釋至 320 ml（總濃度是 1 × 凝膠緩沖液）。將 200 ml 1 × 凝膠緩沖液倒入下層緩沖液槽。剩余的 1 × 凝膠緩沖液加入還原型谷胱甘肽（干粉）至終濃度 1 mmol/L，將它們倒入上層緩沖液儲槽。

4. 將凝膠連接于恒壓/恒流電源。每塊膠 10 mA 預電泳 45 min。關閉電源，將凝膠放置過夜。

5. 傾出凝膠緩沖液，用紙巾或濾紙吸干加樣孔。往下槽倒入 200 ml 1 × 下槽緩沖液。150 ml 1 × 上槽緩沖液加入 0.1 g 巰基乙酸，倒入上槽。

6. 將蛋白質樣品溶于樣品緩沖液，用微量注射器或凝膠加樣吸頭加樣。對 0.75 mm 厚的 5 孔的微型凝膠每孔上樣 < 30 μl。上樣一已知蛋白質作為對照（如 β-乳球蛋白）。

7. 在 10 mA 下電泳至粉紅色的示蹤染料（焦寧 Y 染料，見輔助方案）達到凝膠的底部（60~80 min）。關閉電源。

8. 用甲醇潤濕 2 張 PVDF 膜，然后浸沒在轉移緩沖液中。

9. 拆卸凝膠夾層，輕輕將玻璃板分開。按下面的次序在小型轉移裝置中組裝轉印夾層：塑料框、海綿、濾紙、凝膠、2 張 PVDF 膜、濾紙、海綿、塑料框（見圖 10.6.1）。確保排除氣泡。

10. 將轉印夾層插入轉移裝置，最靠近陽極（紅色或正極）的是膜。用轉移緩沖液充滿裝置。在轉移裝置電極間的電壓降為約 6 V/cm 的條件下（如 LKB 的 Midget MultiBlot，用 50 V），轉移時間因目標蛋白和凝膠的濃度而異。關閉電源。

11. 拆卸轉印裝置，取出 PVDF 膜，將它浸沒于含 0.1％ 考馬斯亮藍的 50％ 甲醇中，搖動 5 min。

12. 用含 10％ 乙酸的 50％ 甲醇脫色，搖動至條帶變得清晰可見（5~10 min）。

13. 轉印膜移入水中，拍照（可選，見 10.5）。

14. 用刀片將目標蛋白的條帶切下（每條帶均用新的刀片），將每一條帶放入一個微量離心管中，室溫風干（不要加熱）。切下的條帶儲存于 -20℃。

15. 將切下的條帶放入測序儀的反應室，蛋白質面朝向溶劑液流（或按廠商的說明）。在自動化測序儀中測序。

在特定的電壓下，15%膠20～50 kDa蛋白質轉移20～40 min；10%～12%膠50～100 kDa蛋白質 轉移70 min；7%膠150～200 kDa蛋白質轉移90 min。對>60kDa的蛋白質，減少轉移緩沖液中 的甲醇量至1%。