采用液相色譜串聯質譜建立了水環境中草甘膦、草氨膦在內的四種強極性農藥的測定方法。樣品直接過濾進樣，在HILIC柱下得到良好的保留效果。質譜檢測采用電噴霧負離子化模式和多反應檢測模式。結果表明，四種化合物在1~500ng/mL范圍內線性良好，線性相關系數在0.979~1.000之間。通過對空白水樣進行加標，方法的平均回收率在95~110%范圍內，四種化合物的方法檢出限為0.5ng/mL。該方法快速，靈敏，適用于水中草甘膦、氨甲基膦酸、草氨膦以及乙烯利的測定。
草甘膦是一種廣譜除草劑，廣泛用于殺滅雜草，尤其是一年生闊葉類雜草和常見與作物競爭生長的雜草。通常來說草甘磷對非靶標生物是有一定毒性的，美國環保署(EPA)將草甘磷列為第三類有毒物質[1]。然而草甘膦由土壤滲透進入地下水或者在水產養殖中用于去除池塘附近雜草，仍然是水環境中不可忽視的農藥。但是由于草甘膦等化合物強極性，導致在傳統反相色譜柱上難以保留，影響分析準確度，所以通常分析前需要與芴酰氯(FMOC-CL)反應，經FMOC衍生后被測試[2]。但是衍生過程增加了分析的復雜程度，所以在一個方法中建立無需衍生的分析方法的需求逐漸增加，并且希望同時可以分析除草甘膦(Glyphosate)及其主要代謝產物氨甲基膦酸(AMPA)外，草銨膦(Glufosinate)及其相似的強極性化合物乙烯利(Ethephon)。文獻報道草甘膦分析方法有氣相色譜法[3]、液相色譜法[4]，以及液相色譜質譜聯用法[5]，其中以液相色譜質譜聯用法最為常見。本研究中，水樣過濾膜過濾直接進入LC-MS/MS分析，無需衍生的草甘膦及其相似極性的殺蟲劑檢測。實驗中展示的原始數據建立在AB SCIEX公司LC-MS/MS平臺上，利用HILIC色譜柱分離，通過空白水樣添加標準溶液的方式模擬日常檢測工作。
實驗部分
儀器與試劑
液相系統采用島津LC-20AXR，配兩個島津LC20AD液相泵，SIL20AC自動進樣器，以及一個CTO20A柱溫箱。AB SCIEX公司LC-MS/MS配Turbo V離子源。Millipore-Elix-QE-QG超純水機(美國 Millipore 公司); CPA 225D 分析天平(德國Sartorius公司)等實驗室常用設備。
草甘膦、AMPA、草銨膦、乙烯利標準品，購于Dr.Ehrenstorfer 公司;乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水;冰醋酸為分析純;標準品用少量甲醇溶解，色譜純甲醇定容配制1 mg/mL 標準儲備液，再根據需要稀釋成適當含量的標準工作液，4 ℃下保存，有效期為2 個月。
色譜條件
化合物在Obelisc N相HPLC色譜柱上分離，柱溫50 ℃，進樣量50 μl，流速1.2ml/min。流動相A相為酸化85%乙腈/水含醋酸胺溶液(乙腈/水:85/15)，B相為酸化含醋酸胺的水溶液。流動相梯度見表1。
表1.用于分離的流動相梯度
|
Step |
Time |
Flow(mL/min) |
A(%) |
B(%) |
|
0 |
2 |
1.2 |
100 |
0 |
|
1 |
3 |
1.2 |
100 |
0 |
|
2 |
3.6 |
1.2 |
0 |
100 |
|
3 |
8 |
1.2 |
0 |
100 |
|
4 |
8 |
1.5 |
0 |
100 |
|
5 |
8.2 |
1.5 |
100 |
0 |
|
6 |
13.5 |
1.5 |
100 |
0 |
|
7 |
13.8 |
1.2 |
100 |
0 |
|
8 |
14 |
1.2 |
100 |
0 |
質譜條件
4種殺蟲劑化合物分析方法在AB SCIEX QTRAP?5500的LC-MS/MS系統上建立，配Turbo VTM離子源電離化合物，負離子模式，噴霧電壓IS為-4500V。其它離子源參數：氣簾氣35psi，噴霧氣(Gas1)60psi，干燥氣(Gas2)70psi，碰撞氣(CAD)為medium，離子源溫度650℃。MRM離子對及化合物保留時間列于表2，每個MRM離子對的駐留時間(dwell time)設置50ms。
表2.化合物LC-MS/MS參數
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Compound |
RT (min) |
Q1 (amu) |
Q3 (amu) |
DP (V) |
CE (eV) |
|
AMPA |
4.3 |
110 |
79 |
-60 |
-24 |
|
110 |
63 |
-60 |
-26 |
||
|
Ethephon |
7.4 |
143 |
79 |
-45 |
-26 |
|
143 |
107 |
-45 |
-12 |
||
|
Glufosinate |
6.0 |
180 |
63 |
-60 |
-66 |
|
180 |
95 |
-60 |
-24 |
||
|
Glyphosate |
6.8 |
168 |
79 |
-110 |
-54 |
|
168 |
63 |
-110 |
-32 |
結果與討論
圖1展示一次進樣采集濃度為10ng/mL標準溶液的色譜圖，圖中包含的4種殺蟲劑的色譜圖。每個化合物監測兩個離子對，并且利用MRM離子對的比例對化合物進行定性確證。
圖1.含量為10ng/mL標準溶液色譜圖。
將標準溶液逐級稀釋，當濃度為0.5ng/mL時四種化合物噪音的S/N均大于3，認定此時為這四種化合物的檢出限。同理，當濃度為1ng/mL時四種化合物噪音的S/N均大于10，認定此時為這四種化合物的定量限。圖2和表3中展示了目標殺蟲劑的校正曲線以及在1-500ng/mL范圍內線性回歸，線性權重按1/X計算。經定量計算后，可以看到所有校正曲線上點的準確度在95-105%之間。
方法中不同化合物的靈敏度列于表3中。所有殺蟲劑均能被識別并定量，滿足歐盟國際標準化合物最大殘留限量(MRL)要求。檢測方法的靈敏度足夠高，所以允許對提取溶液進行稀釋以期望盡可能減少基質干擾。
表3.化合物離子對信息及1-500ng/mL測試范圍內線性回歸
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Compound |
MRM transition |
Linearfit(r值) |
S/N 1 ng/mL |
|
AMPA |
110/79 |
0.999 |
131 |
|
110/63 |
0.999 |
234 |
|
|
Ethephon |
143/79 |
0.979 |
58 |
|
143/107 |
0.984 |
155 |
|
|
Glufosinate |
180/63 |
1.000 |
88 |
|
180/95 |
0.999 |
47 |
|
|
Glyphosate |
168/79 |
0.999 |
52 |
|
168/63 |
0.999 |
102 |
*濃度為1ng/mL標準溶液的信噪比(S/N*);S/N值由MultiQuantTM軟件自動計算
圖2.極性殺蟲劑濃度1-500ng/mL范圍內校正曲線。
方法的驗證使用標準添加到空白基質中來衡量。圖3和圖4展示4種不同極性殺蟲劑，基質中添加標準的水平控制在100ng/mL時的色譜圖。實驗中使用污水、地表水、地下水以及飲用水等四種基質，針對不同基質分別進行測試。
圖3 100ng/mL添加到地表水基質后色譜圖。
圖4.100ng/mL添加到污水基質后色譜圖。
通過空白基質加標10ng/mL和100ng/mL兩個水平，每個水平重復5次測試，得出結論方法不受基質效應影響，回收率在95%~110%之間。該方法重復性良好，可用于日常實驗室監測分析水樣本中四種強極性農藥。由于實驗室樣本量大，分析數據多等問題，實驗過程中使用MultiQuantTM數據分析軟件。軟件可根據客戶需要定義不同的條件，如設定篩選條件為MRM比例和標記出超過最大殘留限量的樣品時，當結果超過設定限量值，軟件將該行標為紅色以示警告。圖5中展示數據采集后運行篩選條件，得到的定量結果和色譜峰。
圖5.MultiQuantTM軟件自動報告殺蟲劑運行篩選功能。
小結
本研究中清楚的展示了草甘膦及一些相似極性的殺蟲劑分析方法，該方法可用于定量檢測低水平的復雜基質樣品，過程中無需衍生，僅需借助高靈敏度的LC-MS/MS 系統分析樣品。這樣對質譜的靈敏度要求比較高，本實驗中采用AB SCIEX QTRAP?5500高靈敏度質譜儀，利用新型HILIC 液相色譜柱分離。即使不是在最理想的酸性流動相條件下，即使流動相中水相比例非常高，即使流速超過1ml/min，由于使用TurboVTM離子源超強霧化能力，能夠實現快速分析這些化合物。這意味著將不再需要FMOC衍生或者超長的離子色譜分析方法分析草甘膦等強極性殺蟲劑，采用本方法即可滿足甚至超出分析要求。