2、發光細菌法
(1)方法原理
發光細菌是一類非致病的革蘭氏陰性微生物,它們在適當的條件下能發射出肉眼可見的藍綠色光(450~490nm)。當樣品毒性組分與發光細菌接觸時,可影響或干擾細菌的新陳代謝,使細菌的發光強度下降或不發光。在一定毒物濃度范圍內,有毒物質濃度與發光強度成負相關線性關系,因而可使用生物發光光度計測定水樣的相對發光強度來監測有毒物質的濃度。
國家標準(GB/T 15441——1995)中,以氯化汞作為參比毒性表征廢水或可溶性化學物質的毒性,也可用半數有效濃度(EC50),即發光強度為最大發光強度一半時的廢水濃度或可溶性化學物質的濃度來表征;選用明亮發光桿菌T3亞種作為發光細菌。因該菌是一種海洋細菌,故水樣和參比毒物溶液應含有一定濃度的氯化鈉。
目前,常采用新鮮發光細菌培養法和冷凍干燥發光菌粉制劑法。
(2)測定要點
①試驗材料的準備:專用生物毒性測試儀,發光細菌瓊脂培養液,液體培養基,0.02~0.24mg/L系列HgCl2標準溶液,新鮮明亮發光桿菌T3亞種或明亮發光桿菌凍干粉,化學毒物或綜合廢水等。
②新鮮發光細菌懸液的制備:從明亮發光桿菌的菌種斜管面中挑取一環細菌接種于新的發光細菌瓊脂斜面上,待斜面長滿菌苔并明顯發光時加入適量稀釋液并制成菌懸液;取0.1mL菌懸液接種于50mL液體培養基中,在22℃搖床震蕩培養至對數生長中期(12~14h),用稀釋液將菌懸液稀釋成5×107個(細胞)/[mL(菌懸液)],置于4℃下保存備用。
③樣品測定:將過濾去除顆粒物雜質的待測水樣加入占水樣質量3%的NaCl,依次加入稀釋液和待測水樣,恒溫(20±0.5)℃后加入等量發光細菌懸液,依次測其發光強度。
④測試結果分析:根據測得的待測水樣的發光強度計算其相對折光率。
3、致突變和致癌物檢測
致突變和致癌物也稱誘變劑,其檢測方法有微核測定法、艾姆斯(Ames)試驗法、染色體畸變試驗法等。
微核測定法原理基于:生物細胞中的染色體在復制過程中常會發生一些斷裂,在正常情況下,這些斷裂絕大多數能自行愈合,但如果受到外界誘變劑的作用,就會產生一些游離染色體斷片,形成包膜,變成大小不等的小球體(微核),其數量與外界誘變劑強度成正比,可用于評價環境污染水平和對生物的危害程度。該方法所用生物材料可以是植物或動物組織或細胞。植物廣泛應用紫露草和蠶豆根尖。紫露草以其花粉母細胞在減數分裂過程中的染色體作為誘變劑的攻擊目標,把四分體中形成的微核數作為染色體受到損傷的指標,評價受危害程度。蠶豆根尖細胞的染色體大,DNA含量多,對誘變劑反應敏感。
Ames試驗是利用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的組氨酸營養缺陷型菌株發生回復突變的性能來檢測被檢物是否具有致突變性。這種菌株均含有控制組氨酸合成的基因,在不含組氨酸的培養基中不能生長,但如果存在致突變物時,便作用于菌株的DNA,使其特定部位發生基因突變而回復為野生型菌株,能在無組氨酸的培養基中生長。考慮到許多物質是在體內經代謝活化后才顯示出致突變性的,Ames等人采用了在體外加入哺乳動物肝微粒體酶系統(簡稱s一9混合液)使被檢物活化的方法,提高了試驗的可靠性。
色體畸變試驗是依據生物細胞在誘變劑的作用下,其染色體數目和結構發生變化,如染色單體斷裂、染色單體互換等,以此檢測誘變劑及其強度。