a.脂多糖屏障丟失(rfa)。用接種環或一端翹起的接種針以無菌操作取各菌株的增菌培養液,在營養瓊脂平板上分別劃平行線,然后用滅菌尖頭鑷夾取滅菌濾紙條,浸濕結晶紫溶液,貼放在平板上與各接種平行線垂直相交蓋好皿蓋后倒置于37℃恒溫箱,培養24h后若紙片周圍出現抑菌帶,則說明測試菌株含有rfa突變。
b.R因子。TA97、TA98、TA100和TA102菌株都含有R因子,這是一個抗藥性轉移因子。檢測R因子存在的方法:橫過營養瓊脂平板表面涂一條小劑量氨芐青霉素鈉溶液,將測試菌株與之交叉劃線,37℃培養12~24h,不含R因子的菌株在氨芐青霉素的擴散區受到明顯抑制,無細菌生長,而含有R因子的菌株則不受其影響。
c.紫外線損傷修復缺陷(△uvrB)。在營養瓊脂平板上按上述方法劃線接種后,一半接種線用黑玻璃遮蓋,另一半暴露于紫外光下8s,然后蓋好皿蓋并用黑紙包裹平皿,防止可見光修復作用。培養同上。
d.自發回變。預先制備底平板,向滅菌并在水浴內保溫45℃的上層軟瓊脂中注入0.1mL菌液,混勻后傾于底平板上并鋪平。平皿倒置于37℃溫箱培養48h。所有菌株在一定培養條件下都有相對穩定的自發回變率超過允許范圍應視為異常。幾種常用菌株的自發回變率分別為:TA97 90~180;TA98 30~50;TA100 120~200;TA102 240~320。
e.回變特性一診斷性試驗。上層軟瓊脂中除菌液外,還注入已知陽性物的溶液,需活化系統者再加入S9mix,其他同上。
菌株鑒定正確結果見表
②測定步驟
a.培養基的接種。取底層培養基平板4皿;融化上層培養基4支,置于45℃下保溫。
分別在每一支上層培養基中分別加入鼠傷寒沙門菌TA98菌株,并加入在37℃培養7h的菌液0.1mL,混合均勻后逐次、迅速倒入底層平板中。
b.施毒。用鑷子將厚的圓濾紙片放入每個皿中心,并在其中三皿中的濾紙上,分別加入50mg/L、250mg/L、500mg/L的亞硝基胍(nitrosoguanidine,NTG)各0.02mL,即每皿分別含NTG 1μg、5μg、10μg,第四皿作為空白對照。
c.觀察結果。將平皿在37℃黑暗處培養2d后,記錄結果。
③結果分析。確定待測化合物在不同濃度時的相對致突變性。TA98菌株在天然條件下會出現自發回復突變(his-),可以在不含組氨酸的底層培養基上生長,故可以對照平板上出現的菌群(自發回復突變)為基準,比較待測物的致突變性。
陰性(一):出現的誘發回變菌落數為自發回變數的2倍以下。
弱陽性(+):誘發回變菌落數為自發回變數的2~10倍。
陽性(+):誘發回變菌落數為自發回變數的10~50倍。
強陽性(+++):誘發回變菌落數為自發回變數的50倍以上。
Ames認為,待測物每皿濃度高達500μg亦不引起大量回變者,為陰性結果。
特別需要指出的是:
a.斑點試驗只局限于能在瓊脂上擴散的化學物質,大多數多環芳烴和難溶于水的化學物質均不適宜用此法。此法敏感性較差,主要是一種定性試驗,適用于快速篩選大量受試化合物。
b.平板摻入試驗可定量測試樣品致突變性的強弱。此法較斑點試驗敏感,獲陽性結果所需的劑量較低。斑點試驗獲陽性結果的濃度用于摻入試驗(每皿0.1mL),往往出現抑(殺)菌作用。
c.試驗作為檢測環境誘變劑的一組試驗中的首選試驗,廣泛應用于致突變化學物的初篩。但該試驗程序還較繁瑣,方法不夠簡便,有待于快速靈敏、簡單易行的環境誘變劑短期生物測試法早日問世。