沉默是金:強大的RNAi篩選技術

　　在過去，想要發現哺乳動物細胞的重要生理過程，通常需要通過化學突變或將轉座子插入到基因組中對細胞內的基因進行干擾。但是，大約10年前，RNA 干擾(RNAi)技術的出現改變了這種狀態。這項技術的核心是，設計一個短鏈RNA，使其在轉錄過程中與目的基因序列互補結合，從而阻止目的基因翻譯成蛋白。RNAi技術的問世，使得對哺乳動物體內每一個細胞內基因進行干擾成為了可能。

　　“這個技術的出現開辟了了解哺乳動物基因功能的一個全新領域。”美國國家衛生研究院國家轉化科學推進中心從事RNAi篩選的科學家Scott Martin說。利用RNAi篩選方法已經發現了許多關鍵的細胞過程，如細胞增殖、細胞凋亡和細胞復制等。

　　盡管近年來RNAi篩選技術在不斷提高，我們擁有了更多有效的RNA探針來干擾目標基因，但是這項技術也存在一定的缺陷。“脫靶效應是主要的限制，” Martin說。你需要采取一定的措施來清除用以沉默靶基因的RNAis而不是靶基因本身，并且還要確保你所選取的靶基因真正參與了某種細胞過程。此外，能正確地選擇最適合的文庫和篩選方式也是一項挑戰。

　　目前，科學家們正在進一步挖掘RNAi技術潛在的強大功能。

　　RNAi篩選方式的選擇

　　為了沉默哺乳動物細胞中的基因，研究人員將21-25個核苷酸長度的雙鏈RNA(siRNA)利用細胞轉染的方法導入細胞，在這種導入方法中，siRNA與脂質囊泡結合，通過細胞的內吞作用或膜融合進入細胞內部。被導入的雙鏈RNA解旋后，其中一條鏈被納入一個細胞蛋白質復合體，稱為RNA誘導的基因沉默復合體(RISC)。RISC與目標基因結合后分解，這樣一來，能與目的基因某一段序列互補的短RNA就能與靶基因某段序列互補結合，從而阻止它們所編碼的蛋白質的產生。另外， RNAi也可以通過向病毒導入設計好的短發夾RNA(shRNA)進入細胞并在細胞內復制得以實現。

　　因此，進行 RNAi篩選的第一步是搞清楚應該使用siRNA還是shRNA文庫。決定這一點的因素之一就是你所要處理的是什么類型的細胞。雖然大多數類型的細胞包括永生化細胞系，使用轉染的方式更佳，也有一些只能在懸浮液中生長的細胞類型，例如免疫細胞、某些原代細胞培養和活體組織細胞不適合轉染的方法。雖然有一些方法可以幫助siRNA分子進入不能使用轉染方法的細胞，如嘗試不同的脂類試劑或者代替脂質載體、利用電脈沖來創建瞬態膜孔(電穿孔)，但是一些細胞仍然破裂了。在這種情況下，就需要使用shRNA方法。

　　siRNA和shRNA之間的選擇也可以理解成基因沉默效應持久度的選擇。轉染后，siRNA在細胞分裂時降解或稀釋，一般只持續5天或6天，馬薩諸塞州醫科大學的助理教授Abraham Brass說道。這個時間應該是足夠用來干擾細胞進程，例如細胞周期控制、細胞凋亡和病毒復制。但是，研究較長的細胞過程需要更持久的沉默效應，如衰老和分化,這可能需要幾星期的時間才能完成。shRNA可以無限期產生穩態水平的siRNA，因為shRNA通常依賴于逆轉錄病毒的復制擴增，但這一過程相對較慢。這意味著DNA被整合到細胞基因組中，伴隨著細胞分裂繼續表達shRNA(雖然病毒經過設計改造，無法傳播，但是你仍然需要做好防護工作)。

　　兩種文庫的另一個關鍵區別是對應的篩選方式不同。一個siRNA在一個排列矩陣中進行：研究人員在多孔細胞培養板進行細胞轉染，每一個孔中包含一種設計好的 siRNA，培養后觀察每一個孔中的細胞表型。然而這種方法需要約200384個孔的培養板來對人類全基因組的每一個siRNAs進行篩選，花費較高、工作量較大。

　　而shRNA可以在一種更簡單的篩選方式中運用——shRNA篩選池。這里，將所有的細胞置于約100000種不同的shRNA 病毒載體中。所使用的病毒的數量很低，確保在大多數情況下，一個病毒只“占領”一個細胞，從而只能表達一種類型的shRNA，沉默一個相應的基因。但這一方法的先決條件是在混合物中找出那些細胞，開發這項技術的哈佛醫學院遺傳學教授Stephen Elledge說。如果基因沉默存活細胞 “成長”，或表達特定的熒光蛋白而“發光”，研究人員都可以通過細胞表型對產生沉默效應的細胞進行區分，隨后再對包含有shRNA的不同細胞進行測序，找到引起相應表型的shRNAs。

　　RNAi篩選文庫的選擇

　　目前，市面上有許多用于siRNA篩選的商用文庫，包括覆蓋整個人類和小鼠基因組的文庫和目標基因集文庫，但是這取決于你擁有什么樣的研究條件。一些設備能提供兩種不同的siRNA庫排列矩陣，siRNA被分別置于不同的孔中進行靶向結合。但是，在單陣列設備中，所有的siRNA在培養板的一個孔中進行靶向結合。后者因為所使用的耗材更少而更高效。

　　一個好的全基因組文庫產品，可以專注于一個較小的基因組合，可以將篩選范圍縮小，節省時間與精力。要作shRNA篩選，你可以定制自己所需要的文庫，無論是病毒形式還是質粒形式。目前可以購買獲得兩種類型的文庫。

　　其一是Broad研究所的RNAi Consortium (TRC)，由Sigma-Aldrich公司銷售。Sigma-Aldrich公司的MISSION LentiPlex，是TRC的制成品，售價在$ 13,000;該公司也經營全基因組文庫和小型文庫的定制項目，收費在10,000和$ 30,000美元之間。

　　另一種是Thermo Fisher Scientific銷售的shRNA文庫，叫做shRNAmir，用途是模擬小RNA( microRNA)在細胞內的表達模式。shRNA-mir文庫在消除靶基因方面具有一定的靈活性，可以很容易地開啟和關閉。而傳統的shRNA文庫總是令啟動子處于開啟狀態。因此這種文庫的可操作性更強。

　　篩選結果的驗證

　　“經過siRNA篩選，我們通常不缺乏候選基因，不知道這是好事還是壞事，”NCATS的Martin說。困難的是證明siRNA基因沉默所產生的表型確實是靶基因沉默所致，而非其它意想不到的基因。研究表明，大多數的細胞表型是由于siRNA的脫靶效應所致。為了排除這些干擾，研究者們已經開發設計出了相應統計方案。

　　一旦排除了干擾，接下來重要的事情就是額外測試3-5個siRNA或shRNA分子對你所設計的目標基因的沉默效應進行驗證。如果多個RNAi分子作用于相同的基因能產生相同的表型，這就說明其效果是真實的，而不是脫靶效應。另一個有說服力的驗證技術是“救援實驗”，這項技術將siRNA和靶基因的其它拷貝同時導入細胞，而這些拷貝本身帶有突變，使得siRNA無法與之結合，如果細胞表型的改變是由siRNA沉默引起的，那么這些拷貝可以恢復表型。而倘若彪形變化不是由基因沉默引起，那么表型保持不變。但是這種類型的實驗的困難在于siRNA-拮抗基因表達水平高，反而會影響其正常功能，因此許多多研究人員跳過了此驗證步驟。