沙門氏菌回復突變實驗

目的 ：學習利用細菌檢測基因突變  的方法

Ames試驗 即鼠傷寒沙門氏菌營養缺陷型回復突變  試驗，是目前檢測基因突變最常用方法之一。

原理 ：利用鼠傷寒沙門氏菌突變株，即組氨酸缺陷型，其原始菌株菌體內的組氨酸是通過自身一系列酶催化反應合成的，這種能自身合成所需營養成份的菌株叫做野生型菌株。本試驗用鼠傷寒沙門氏菌為突變株，其不能合成組氨酸，而必須由外界提供這種菌珠被稱為營養缺陷式營養實變型（his-）。當誘變劑作用于菌株后，在菌株遺傳物質的特定位點發生基因回復突變成為野生型（his+），故在缺乏組氨酸的培養基上，只存少數自發回變菌落生長，而能誘發細菌  回變的致突變物可使細菌生長增多，從而可判斷被藥物是否具有致實變性。

材料 ：菌株，鼠傷寒沙門氏菌TA97，TA98，TA100，TA102。
器材 ：恒溫培養箱，干燥箱，高壓消毒鍋，水溶鍋，紫外線燈（15w），藥物天平，分析天平 酒精燈，濾紙片，平皿，試管，燒杯，吸管。

培養基配制

1．Vogel-Bonner液10×（VB液10倍濃縮）用于配制底層基本培養基。配制方法：硫酸鎂（MgSO4·7H2O）1g，檸檬酸（C6H8O7·H2O）10g，磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）65.5g，磷酸氫銨鈉（NaNH4HPO4·4H2O）17.5g。將上述成分依次用蒸餾水溶解、混勻，然后加蒸餾水至500ml，置4℃冰箱保存。

2．底層基本培養基 取VB液（10倍）100ml，加入蒸餾水800ml，用1mol/L NaOH調pH至7.0，然后加入瓊脂12—15g，經121℃20分鐘高壓滅菌。待冷至800C左右時，加入100ml已經112℃20分鐘高壓滅菌的20%葡萄糖液，混勻后澆制平板。

3．上層培養基 D-生物素12.4mg，L-鹽酸組氨酸9.5mg，NaCl5g，瓊脂6g，上述成分依次加熱溶解，混合，然后加蒸餾水至1000ml。分裝后經121℃15分鐘高壓滅菌備用。

方法

1．藥物的劑量選擇

對于易溶解的藥物，實驗最高劑量可采用抑菌濃度下的最大劑量，或以最大溶解度為最高劑量和5mg/皿為最高劑量，下設5個劑量，（即5000，500，50，5，0.5，0.1μg/皿）。溶劑：藥物是水溶性，可用滅菌蒸餾水，如非水溶性可選二甲亞砜為溶劑。

2．平板摻入法

每皿加底層培養20～25ml，待凝固。取融化并保溫于45℃的上層培養基，分裝于5ml試管中，每支試管2ml，依次加入新鮮菌液0.1ml， 藥物0.1ml，需加S9時則加入S9混合液0.3ml，混勻，迅速倒在底層培養基上，使之分布均勻。待上層瓊脂凝固后，翻轉平板置37℃培養48小時后，觀察結果。

結果評價

觀察結果時，首先應觀察各實驗組和陰性對照的背景菌苔的生長情況。在肯定背景菌苔與陰性對照相差不多后，再比較各劑量組的回變菌落數。若回變菌落數的出現有劑量反應關系，回變菌落數大于自發對照的2倍或以上，結果并具有重現性，并有統計學意義的增加，可判斷為陽性，反之為陰性。