1、原理
用特異性的 DNA 探針進行沙門氏菌核糖體 RNA(rRNA)的檢測。待檢樣品經前增菌、選擇性增菌和后增菌后,溶解細菌。加入標記好的沙門氏菌特異性的 DNA 探針用于液相雜交。如果待檢樣品中存有沙門氏菌 rRNA,熒光素標記的檢測探針和多聚脫氧腺嘌呤核苷酸(polydeoxyadenylic acid,poly dA)末端捕獲探針將與目標 rRNA序列進行雜交。然后把包被有多聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸(polydexythmidylic acid,poly dT(固相)的測桿插入雜交溶液。 poly dA 和poly dT之間進行堿基配對,便于探針捕獲:目標雜種核酸分子結合在固體載體上,未接合的探針被沖洗掉。測桿被培養在辣根過氧化物酶抗熒光素接合劑中。接合劑與存在于雜交檢測探針上的熒光素標記物結合,未結合的接合劑被沖洗掉。并將測桿培養于酶底物色原溶液中,辣根過氧化物酶與酶底物反應,將色原轉變為藍色化合物。一旦遇酸反應便停止,色原的顏色變為黃色在450nm處測量吸收值,吸收值大于臨界值則表明在待檢的樣品中存有沙門氏菌。
2、儀器
①光度計 在450nm 處測量吸收值。能容納裝有1mL 溶液的12mm×75mm 試管的空白和樣品槽。
②試管架 需要3個。塑料的、耐熱(65℃),至少可容納12mm×75mm試管50支。最少5個槽/排,槽與槽間隔18mm(從兩槽的中心測量)。
③測桿支架 每排可支持5個測桿的塑料裝置。每個測桿之間的間距為18mm(中心一中心)。
④沖洗槽 需要4個金屬的或塑料的耐熱(65℃),10cm×10cm×9cm 帶蓋容器⑤試管 12mm×75mm 玻璃試管。
⑥恒溫水浴 能于65.0℃±1.0℃ 恒溫。能容納1個試管架和1個沖洗槽。水位5cm。
⑦可重復使用的移液器 任選,具有注射器一吸水管尖頭。能精確地吸移0.1mL,0.2mL,0.25mL和0.75mL。也可用血清學移液管代替。
3、試劑
①濃縮細胞溶解劑 凍干蛋白酶 K。
②細胞溶解劑緩沖液 5%sakosyl,0.0025mol/L乙二胺四乙酸二鈉,0.26mol L Tris,0.08%溴酚藍水溶液。
③探針溶液 熒光素標記的、沙門氏菌特異性的、合成的低聚核苷酸 DNA 探針和在pH7.5 1.05mol/L Tris,0.5mol/L 乙二胺四乙酸二鈉,0.05%牛血清白蛋白,0.05%NP40(無離子洗滌劑),0.025%甲酚紅和0.05%疊氮鈉中的 polydA-末端、沙門氏菌特異性的、合成的低聚核苷酸 DNA 探針。沙門氏菌探針必須顯示出其特異性并與其他腸桿菌科和其他細菌無交叉反應。通過檢測在 GN 肉湯中35℃生長18～24h 的與沙門氏菌具有高同源性的非沙門氏菌的純培養物(未經稀釋)來測定其特異性。合適的特異性檢驗方式應包括可能存在于食品中所有沙門氏菌亞屬的多種典型菌和其他菌群的典型菌,特別是其他腸桿菌科的細菌。
④20倍濃縮的沖洗液 含有1.0mol/L Tris,pH7.5;0.4mol/L乙二胺四乙酸二鈉:3.0mol/L 氯化鈉和0.2%吐溫-20。
⑤酶接合劑 100倍濃縮的辣根過氧化酶抗熒光素多克隆抗體接合劑。
⑥酶底物-色原溶液 尿素過氧化物、四甲基聯苯胺、9%二甲亞砜、9%二甲基甲酰胺。
⑦終止液 2mol/LH2SO4。(當心:腐蝕劑,避免與皮膚接觸。若一旦接觸,用冷水徹底地沖洗皮膚。)
⑧測桿 聚苯乙烯測桿,8cm(5cm 手柄,3cm臂。臂有5個包被poly dA的漿狀的突起物,包被 poly dT 的測桿的結合能力應大于250ng poly dA。應檢測測桿與其他試劑的基質結合的能力以保證固有的方法的靈敏度。
⑨陽性對照液 甲醛滅活的鼠傷寒沙門氏菌。當檢測試樣時,其濃度足以產生≥1.0的吸收值。所用的有效的菌體濃度可隨其制備時所用的菌株、培養基和條件而變化。
⑩陰性對照液 甲醛滅活的弗勞地枸櫞酸桿菌當雜交和/或沖洗溫度<64℃時,在試樣中足以產生>0.15的吸收值,正確地進行檢測,陰性對照液應產生≤0.15的吸收值。所用的有效菌體濃度可隨其制備的菌株、培養基和條件而變化。
?GN肉湯 20g胰蛋白胨、1g葡萄糖、2.0g甘露醇、5g枸橡酸鈉、0.5g去氧膽酸鈉、1.5g磷酸二氫鉀、4g磷酸氫二鉀、5g NaCl。溶解各成分于1L H2O中,分裝于16mm×125mm試管中,每管10mL。旋松試管帽,于121℃高壓滅菌15min在25℃時,最終pH值應為7.0±0.2。
?診斷試劑 必要時,用于 DNA 雜交分析陽性的培養物的確證。見常規培養鑒定方法。
①～?項可從 GENE-TRAK 系統購得。用作沙門氏菌 GENE-TRAK 比色檢測(用于沙門氏菌檢測的DNA雜交實驗)。于2～8℃貯存濃縮細胞溶解劑、探針溶液、100倍濃縮的接合劑、酶底物-色原溶液、陽性對照液和陰性對照液。細胞溶解劑在用溶解劑緩沖液溶解后,貯存于-20℃。在室溫下(<30℃)貯存所有其他溶液和測桿。
4、通則
每組檢樣測試包括1個陽性對照和1個陰性對照。
不要用手指觸摸測桿的尖部,僅握住手柄;不要重復使用測桿和沖洗液。
每一樣品和試劑需用單獨的移液器或吸嘴,以避免交叉污染。注意不要用酶接合劑污染酶底物-色原混合物。用后應按要求立即放回到2～8℃冷藏。參照每個試劑瓶上標明的要求貯存。
接觸細菌培養物的所有器材均作為生物有害物質加以處理,并用適當的方法消除其污染。
(注意:探針溶液含有0.1%疊氮鈉。該試劑的廢棄物倒入洗槽中時,應立即用大量的水沖洗以避免與自來水管中的銅或鉛化合物形成爆炸性的殘留物)。