1.標本采集男性患者可取泌尿生殖道分泌物、前列腺液、精液定量培養可取初段尿、中段尿。女性除宮頸和陰道拭子外羊水、尿道分泌物也可用于檢測。若要測特異性抗體，可采集血液標本。標本采集后應盡快送檢，一般不超過3h因支原體無細胞壁，對干燥特別敏感且代謝產物積累不利于其生長繁殖。
支原體的實驗室診斷有培養特異性抗體檢測、代謝抑制試驗、DNA探針和PCR技術等，以培養最為可靠，PCR技術最為敏感。
2.分離培養按患者性別和病變部位不同分別在無菌條件下采取不同的標本，立即接種于液體培養基中。液體培養基顏色發生變化時就轉種到固體培養基。
3.特異性抗體檢測生殖支原體感染部分患者可測出抗體，但敏感性不高，重復性差未能用于臨床。采用ELISA法可檢出解脲脲原體的IgM和IgG抗體，較敏感，特異性強有早期診斷意義。
4.DNA探針技術此法敏感，因需同位素，難以推廣應用。
5.PCR技術由于其敏感性高，特異性好，現已從實驗研究階段進入臨床應用階段。逐步成為臨床快速診斷的重要手段。
6.內鏡檢查，可直接觀察泌尿生殖系統炎癥病變。