活體動物體內生物發光和熒光成像技術基礎原理與應用四

二、活體動物熒光成像技術

（一）技術原理

1．標記原理

活體熒光成像技術主要有三種標記方法。

（1）熒光蛋白標記：熒光蛋白適用于標記細胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等；

（2）熒光染料標記：熒光染料標記和體外標記方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以標記抗體、多肽、小分子藥物等；

（3）量子點標記：量子點（quantum dot)是一種能發射熒光的半導體納米微晶體，是由數百到數萬個原子組成的原子簇，尺寸在100nm以下，外觀恰似一極小的點狀物。量子點作為一類新型的熒光標記材料，其在長時間生命活動監測及活體示蹤方面具有獨特的應用優勢。與傳統的有機熒光試劑相比較，量子點熒光比有機熒光染料的發射光強的20倍，穩定性強100倍以上，具有熒光發光光譜較窄、量子產率高、不易漂白、激發光譜寬、顏色可調，并且光化學穩定性高，不易分解等諸多優點。主要應用在活細胞實時動態熒光觀察與成像，可以在長達數天內進行細胞的分化和世系觀察, 以及細胞間、細胞內及細胞器間的各種相互作用的原位實時動態示蹤。不但如此，量子點還可以標記在其他需要研究的物質上，如藥物、特定的生物分子等，示蹤其活動及作用。

2．光學原理

熒光發光是通過激發光激發熒光基團到達高能量狀態，而后產生發射光。同生物發光在動物體內的穿透性相似，紅光的穿透性在小動物體內比藍綠光的穿透性要好得多，隨著發光信號在體內深度的增加，波長越接近900nm的光線穿透能力越強，同時可消減背景噪音的干擾，近紅外熒光為觀測生理指標的最佳選擇。在實驗條件允許的條件下，應盡量選擇發射波長較長的熒光蛋白或染料。

（二）活體動物熒光成像技術應用領域

1．腫瘤學

活體熒光成像技術能夠無創傷定量檢測小鼠的皮下瘤模型。相對于生物發光成像技術，活體熒光成像技術檢測時間較快，只需要不到1s的時間，同時不需要注射底物，節約了檢測成本。但是需要選擇近紅外熒光檢測深部組織，目前此波段的熒光蛋白種類有限，精確定量較難。

（1）GFP標記的肺腫瘤模型（H-460-GFP）

H-460-GFP是一個綠色熒光蛋白表達細胞系，它起源于H-460肺小細胞肺癌，穩定轉染了綠色熒光蛋白基因，并由SV-40啟動子起始基因的表達。

通過H-460-GFP皮下腫瘤模型，建立小鼠肺癌的實驗模型，可用來進行有關抗癌藥物的篩選（圖11-3）。可用于測量皮下腫瘤的生長和監測對潛在化學治療藥物的反應。

圖11-3  左圖是接種后1w熒光成像，右圖是3w熒光成像（上海市腫瘤研究所供圖）

（2）量子點標記細胞系

通過量子點可以標記腫瘤細胞，用量子點Qtracker? 705對MDA-MB-231乳腺癌細胞進行標記，皮下接種后動態觀察其生長以及變化（圖11-4）。激發光波長625nm ，散射光波長680nm。

圖11-4 量子點標記腫瘤細胞不同時間熒光成像

2．抗體

分子探針的一端聯有能夠和生物體內特異靶點結合的分子結構（如肽類、酶的底物、配體等），另一端則是熒光染料。通過Cy5.5標記的抗體的體內代謝實驗，可見肝、腎等處的分布（圖11-5）。

圖11-5   Cy5.5標記的抗體的體內代謝實驗（上海市腫瘤研究所供圖）