活體成像中熒光色素標記細胞的方法

實驗概要

本實驗以研究干細胞活體移植后的存活率為例，簡介了一兩種內源性熒光色素標記的實驗方法。

實驗原理

活體光學成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發光（bioluminescence）技術與熒光（fluorescence）技術。生物發光是用熒光素酶(Luciferase)基因標記細胞或DNA，今天，生物發光標記物可以標記到任何一種基因上，使對基因功能的全面細致研究成為現實。而熒光技術則采用熒光報告基團（GFP、RFP，Cyt及dyes等）進行標記，利用熒光蛋白在外源光源或是內源發光照射下被激發產生的熒光作為檢測信號。研究人員能夠利用一套非常靈敏的光學檢測儀器直接監控活體生物體內的細胞活動和基因行為。
該技術可被廣泛應用于標記細胞或基因的示蹤及檢測；基因治療在活體動物體內直接的觀察和檢測；基因組、蛋白組學、藥學及生物技術在活體動物內的研究；藥物及化學合成藥物的藥物代謝及毒理學監測；食品菌落生長成像；皮膚醫學中皮膚疾病的體內成像；法醫鑒定；微孔板成像，例如：免疫分析、報告基因、基因探針和嗜菌作用分析等；熒光團的體內成像，例如：Alzheimer疾病研究中結合嗪的β-淀粉沉淀物分析；轉基因植物中通過報告基因對生理周期節奏的研究；凝膠成像分析等等。

實驗步驟

1. 用熒光色素DiD標記間充質干細胞
   1) 先用胰蛋白酶消化待標記材料，使之成為一定密度的懸浮液；
   2) 從細胞培養箱中取出間充質干細胞，吸取含原有培養基的細胞懸浮液進行標記；
   3) 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含鈣鎂離子的磷酸緩沖液）清洗細胞，吸去PBS，鈣鎂離子會影響胰蛋白酶的活性，必須小心；
   4) 加入預熱的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶為例，每瓶加5ml，確保瓶的表面被完全覆蓋；
   5) 在細胞培養箱中37° C 孵育約 5 分鐘；
   6) 然后在顯微鏡下確認細胞已經完全分散，如果有細胞貼壁情況，輕拍若干次或延長孵育時間直至酶解消化完全成功；
   7) 加入等量含 10% FCS的培養基中和胰蛋白酶；
   8) 用移液器反復吸取幾次確保細胞均勻分散；
   9) 然后移取細胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；
   10) 400 RCF離心5 分鐘；
   11) 小心移去上清液，不要擾動細胞；
   12) 將細胞重新懸浮于DMEM 并進行計數；
   13) 需要待標記細胞在無血清DMEM溶液中的密度應為1x10⁶/ml ；
   14) 每ml細胞懸浮液加入5 μL DiD 染色液；
   15) 用移液器將染色液與細胞懸浮液混合均勻；
   16) 在6孔低附著性細胞板上37°C 孵育20分鐘；
   17) 孵育完全后移取細胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；
   18) 400 RCF離心5 分鐘；
   19) 小心移去染色液，不要擾動細胞；
   20) 用PBS清洗細胞，用移液器反復吸取幾次確保細胞均勻分散；
   21) 重復洗三次；
   22) 細胞重新計數并用臺盼藍染色法檢測細胞活性；
   23) 進行活細胞成像。

2. 用熒光色素ICG標記人胚胎干細胞
   1) 必須先準備好吲哚菁綠溶液（血容量、心輸出量、肝功能測定劑）作為對照品，然后使之與轉染試劑魚精蛋白（抗凝血作用）混合；
   2) 測出1ml吲哚菁綠溶液的活力，然后在100 μL DMSO中溶解ICG；
   3) 向混合物中加入 400 μL Dulbecco的改良Eagles 培養基 (DMEM加10% 胎牛血清)，震蕩均勻，吲哚菁綠溶液終濃度為2mg/ml；
   4) 加入轉染試劑魚精蛋白，魚精蛋白作為對照品的載體，使之能夠有效進入細胞；
   5) 在300 μL ICG 和 300 μL 無血清Dulbecco改良 Eagles 培養基中混入 5 μL 硫酸魚精蛋白溶液，使之終濃度為 10mg/ml，；
   6) 震蕩5分鐘使之形成復合物，標記溶液制備完畢；
   7) 從 hESC 10mm Petri 培養皿中移去原有培養基；
   8) 加入5ml預熱的 DMEM；
   9) 加入制備好的魚精蛋白/ICG 溶液， 37°C下孵育1h；
   10) 孵育完全后移去染色液；
   11) 用5 ml PBS漂洗培養皿以清除染色液；
   12) 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37°C下孵育5分鐘使之酶解，適當震搖培養皿效果會更好；
   13) 用移液器反復吸取幾次確保細胞均勻分散；
   14) 加入等量含 10% KSR的培養基中和胰蛋白酶；
   15) 然后移取細胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中，400 RCF離心5 分鐘；
   16) 在全培養基中懸浮細胞；
   17) 如果還有細胞團塊，可以移去原有培養基用10ml預熱的全ESC培養基重新懸浮細胞，重復酶解再離心；
   18) 在這一點上，鼠源飼喂細胞需從hESCs中分離；
   19) 然后將細胞懸浮液移至涂布瓊脂的10 cm 培養皿中；
   20) 37°C 孵育 45 分鐘，注意不要晃動培養皿，如此鼠源飼喂細胞會貼壁而干細胞保持懸浮；
   21) 從Petri 培養皿中移出已標記的單細胞人胚胎干細胞懸浮液；
   22) 細胞重新計數并用臺盼藍染色法檢測細胞活性；
   23) 進行活細胞成像。