活體電穿孔法介紹（二）

電　壓
電穿孔時在能量導入一定的情況下設計施加電壓的值。電壓過低或過高都會影響外源基因的表達。電壓過低時,無法造成細胞膜表面狀態的改變,因而外源D不能進入細胞內。電壓過高時,局部組織積聚過多熱量,造成細胞的死亡或組織失去功能,即使外源基因導入細胞,也無法進行正常的表達。哺乳動物常用的活體電壓大多為20～100VPcm
,最高電壓在250～750VPcm。

電穿孔次數和時間
有試驗證明,皮膚的電阻在每一次電穿孔后都有所降低，說明電穿孔使皮下組織形成孔道,且其大小隨電穿孔而變大,經過電穿孔的處理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊內表達。但電穿孔次數不能過多,否則會對局部的細胞組織造成不可逆的損害,基本應在10 次以內,每組電穿孔時間應在20～100msec 。

能量的測算
電穿孔過程中能量的測算公式為: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表電穿孔時導入的能量,V 代表施加的電壓,T 代表電穿孔延續的時間,R 代表作用組織的電阻。試驗證明在導入能量一定的情況下外源基因轉移效率也相近。在此原則基礎上可根據不同的組織器官選擇不同的電壓和電穿孔時間。

溫　度
由于電穿孔瞬間在局部會產生大量熱,因此操作過程中,DNA 轉染試劑應保持4 ℃,同時電穿孔操作部位的溫度也應適當降低,Muramatsu 證明溫度較低的情況下,外源基因的轉移表達效率會有明顯的提高。此外在電穿孔操作部位溫度降低的同時可以有效抑制局部組織的出血和外源DNA 的流失,這樣也在一定程度上保證了基因的導入效率。
DNA 的狀態和濃度很多試驗都證明線狀DNA 較環狀DNA 在活體電穿孔法瞬時表達系統的建立中效果較好[12 ] 。DNA 的濃度應在1～40mgPml 范圍內。DNA 溶液組分DNA溶液中不應含有不能分解成離子的組分,如甘露糖醇、蔗糖等。這些大分子存在時會降低基因的轉移效率。

5、活體電穿孔法在不同組織上的應用
肌肉組織
在肌肉組織中最初進行外源基因活體導入是采用電穿孔法。選擇肌肉組織作為靶組織是因為肌肉組織在體內所占比例很大,約占40 % ,而且外源基因可在肌肉中長期表達、分泌,在基因治療中經常會用到。此外,外源基因也不會因肌細胞的分裂而丟失。

皮　膚
皮膚組織相對于其他組織較難進行電穿孔法的基因導入,因為皮膚比較薄,電阻相對低,要求電流較高。但如果電流過大,會嚴重影響基因的表達,因此應適當降低電流和電壓,延長電穿孔的時間。另外,由于皮膚組織含有的脂肪細胞分布不均,會干擾電穿孔的作用,因此只推薦用鑷狀電極,且應將動物被毛刮凈后操作。雖然外源基因在皮膚中表達的時間較肌肉中短,但可利用活體電穿孔法對很多皮膚疾病進行治療。

肝　臟
由于肝臟的生理代謝十分旺盛,因此外源基因在肝臟中的表達時間往往很短暫,而且表達產物的水平也較低。為減少出血,可從小靜脈注入，然后在肝臟上施加電場,能顯著增強基因的表達。

睪　丸
相對于其他的轉基因方法,活體電穿孔法可使外源基因在睪丸中產生大量和持久的表達。此外,很多研究人員希望利用活體電穿孔法將外源基因導入精子, 進而通過授精得到轉基因動物。Yamazaki 等[13 ] 和Ryoki 等[14 ] 用甲磺酸丁二醇二酯注射或用手術法將動物人為造成隱睪,大部分體細胞和分化了的精母細胞減少,這樣使外源基因導入精原細胞的幾率增加。Ryoki 等[14 ] 將基因與病毒誘導的整合酶基因共轉染,可在精原細胞中檢測到外源基因的表達,且病毒誘導的雙基因共轉染較單基因整合效率更高。但目前用這種方法獲得轉基因動物還較難。

禽類輸卵管
對禽類輸卵管活體電穿孔的研究很少,但這一方法卻有很廣闊的發展前景。因為輸卵管腺體細胞具有很強的分泌功能,可以將大量蛋白分泌到雞蛋中。也可以利用此瞬時表達系統檢測含卵清蛋白啟動子的載體功能。Park
等用活體電穿孔法以熒光素基因導入雞輸卵管上皮,檢測到熒光素活性約4500RLUPmg 組織[15 ] 。

眼睛、胚胎和禽類胚盤
這三種組織都是很脆弱的,如果實施基因槍法,會使靶組織因強烈的機械損傷而失去功能或直接導致發育停滯。Sakamoto 將血纖蛋白溶酶原激活因子基因導入眼睛中,有效抑制了眼睛在淤傷后血纖蛋白的反應。哺乳動物胚胎的電穿孔操作包括離體和子宮內操作。禽類胚胎基本是在蛋殼中進行電穿孔的,而且表達快速,Momose 等報道電穿孔施加后215 小時在雞胚中就可以檢測到外源基因的表達,這在使用病毒載體時也是不可能的。當電場被限定在一個很小的范圍內時,基因可以定點表達, 這是活體電穿孔法的又一優點,Katahira 等[17 ] 證實可將外源基因導入雞胚大腦、心臟和一些微小組織(如中胚層,間充質和體節) 中進行表達。

6、 活體電穿孔法進行基因治療及外源基因表達的調控
6．1 　活體電穿孔法在基因治療方面的應用

原來在基因治療中利用活體電穿孔法將抗體或化療藥物導入腫瘤中,促進抗體和化療藥物的運送來進行治療,現在則以特異的外源基因替代了抗體的應用,簡化操作步驟同時降低了費用。

首先,在皮膚瘤和腦瘤的治療中,電穿孔法可有效地將藥物基因導入治療部位。電穿孔法導入人單核細胞趨化物蛋白基因到大鼠腦瘤后,該蛋白在腫瘤的局部表達,同時在基因導入的部位可觀察到巨噬細胞和白細胞的聚集。

同時有科學家從另一角度研究電穿孔對治療腫瘤方面的作用,利用高電場強度的陡脈沖促使腫瘤細胞發生不可逆性電擊穿而最終死亡,這種方法很適于局部組織腫瘤的治療。

此外,活體電穿孔法還可以參與癌癥的治療,通過活體電穿孔法將基因導入機體后,導入組織可成為分泌抗體等物質的臨時分泌器官,以抵抗癌細胞的侵蝕或代償由于癌細胞的侵蝕而造成的機體多種生理機能的喪失。

除了可以利用活體電穿孔法對腫瘤進行局部治療外,還可以治療機體的內分泌系統和免疫系統的疾病。可在機體局部以活體電穿孔法導入編碼分泌型蛋白的基因,這種重組的治療蛋白可以隨著血液循環分布到全身各種組織和細胞進行治療。如在活體電穿孔骨骼肌導入EPO 基因后,可通過紅細胞比容值檢測到EPO 基因表達產物的增加。Yasui 等在小鼠體內檢測到活體電穿孔法導入的胃泌素基因的表達產物和人的單克隆抗體。

在不遠的將來,研究人員可以選擇機體的一種組織的某個位置作為活體電穿孔的靶位點,將治療基因從該位點導入進而表達,因此又可以把這個特殊的組織當作機體的一個人造的內分泌或免疫組織,對病人進行相應的治療。活體電穿孔法可對系統疾病產生作用并且安全有效。將不同類型的耐藥基因同時導入造血細胞,以擴大耐藥范圍和進行體內選擇是基因治療的重要策略,這類載體基因片段大多較長,進行傳統基因導入有一定的難度。有報道可以用活體電穿孔法將醛脫氫酶基因和多藥耐藥基因共轉移并在PA317 細胞中獲得高效表達,轉導率達98 % ,測定藥物蛋白表達較常規方法增高4 倍。此外電穿孔法有很高的經皮促滲作用,可進行很多經皮給藥的治療。

6．2 　基因治療中外源基因表達的調控
研究人員大都不希望導入的外源基因過度表達,尤其在基因治療中,我們希望外源基因表達的誘導和抑制能夠得到控制。目前這方面的研究主要包括兩個方面:效應元件調節和生理活動調節。效應元件的作用,例如類固醇類激素誘導的效應元件中,在卵清蛋白啟動子5′遠端019kb 處有一個雌激素效應元件,將具有此元件的基因導入成年母雞后,在其皮下注射糖皮質激素和雌激素,便可誘導外源基因的高效表達,表達量較未經激素誘導的對照組增加10 倍。