活細胞免疫熒光技術－流式細胞儀標本的制備

細胞樣品

兔血清第二抗體單克隆抗體FCS-RPMI1640DPBS

玻璃管塑料管離心機熒光顯微鏡

制備活性高的細胞懸液（培養細胞系、外周血單個核細胞、胸腺細胞、脾細胞等均可用本法）

1. 用10％ FCSRPMll640 調整細胞濃度為5×10⁶—1×10⁷／ml

2. 取40 μl細胞懸液加入預先有特異McAb（5——50 μl）的小玻璃管或塑料離心管，再加50 μl 1:20（用DPBS稀釋）滅活正常兔血清。

3. 4℃靜置30 min。

4. 用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2 ml，1000 r／min×5 min。

5. 棄上清，加入50μl工作濃度的羊抗鼠（或兔抗鼠）熒光標記物，充分振搖。

6. 4℃靜置30 min。

7. 用洗滌液洗滌2次，每次加液2 ml，1000 r／min×5 min。

8. 加適量固定液（如為FCM制備標本，一般加入1 ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細胞濃度加入100—500 μl固定液）

9. FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察，（標本在試管中可保存5——7天）

1. 整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規防腐劑量高10倍的NaN3，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發生交聯、脫落。

2. 洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現假陰性。

3. 加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。

4. 細胞活性要好，否則易發生非特異性熒光染色。

來源《實驗動物與動物實驗方法學》