流式細胞儀主要構造和工作原理（一）

一. 流式細胞術概述

流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)是七十年代發展起來的高科學技術,它集計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學于一體, 同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內DNA、RNA含量等,可對群體細胞在單細胞水平上進行分析, 在短時間內檢測分析大量細胞,并收集、儲存和處理數據,進行多參數定量分析; 能夠分類收集(分選)某一亞群細胞,分選純度＞95%。在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應用。
國內使用的流式細胞儀主要由美國的兩個廠家生產:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(簡稱B-D公司)。流式細胞儀主要有兩型:臨床型（又稱小型機、臺式機）和綜合型（又稱大型機、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新產品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D公司最新產品為FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型，除具備檢測分析功能外,還具有細胞分選功能,多用于科學研究。

二.流式細胞儀主要技術指標

1．流式細胞儀的分析速度：

一般流式細胞儀每秒檢測1000～ 5000個細胞,大型機可達每秒上萬個細胞。

2．流式細胞儀的熒光檢測靈敏度：一般能測出單個細胞上<600個熒光分子,兩個細胞間的熒光差＞5%即可區分。

3．前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：前向角散射（FSC）反映被測細胞的大小,一般流式細胞儀能夠測量到0.2μm～０.5μm。

4．流式細胞儀的分辨率：通常用變異系數CV值來表示，,一般流式細胞儀能夠達到<2.0%,這也是測量標本前用熒光微球調整儀器時要求必須達到的。

   5．流式細胞儀的分選速度：一般流式細胞儀分選速度＞1000個/秒，分選細胞純度可達99%以上。

三.流式細胞儀主要構造和工作原理    

流動室及液流驅動系統

流式細胞儀主要由以下五部分構成:①流動室及液流驅動系統②激光光源及光束形成系統③光學系統④信號檢測與存儲、顯示、分析系統⑤細胞分選系統。

流動室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式細胞儀的核心部件，流動室由石英玻璃制成，單細胞懸液在細胞流動室里被鞘流液包繞通過流動室內的一定孔徑的孔,檢測區在該孔的中心，細胞在此與激光垂直相交，在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區。流動室里的鞘液流是一種穩定流動，控制鞘液流的裝置是在流體力學理論的指導下由一系列壓力系統、壓力感受器組成，只要調整好鞘液壓力和標本管壓力, 鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向，能夠保證每個細胞通過激光照射區的時間相等，從而使激光激發的熒光信息準確無誤。見圖12.1流動室示意圖。流動室孔徑有60μm、100μm、150μm 、250μm等多種，供研究者選擇。小型儀器一般固定裝置了一定孔徑的流動室。
圖12.1流動室示意圖(采自Coulter Training Guide)

激光光源及光束形成系統

流式細胞儀可配備一根或多根激光管，常用的激光管是氬離子氣體激光管，它的發射光波長488ηm,此外可配備氦氖離子氣體激光管（波長633ηm）和/或紫外激光管。

流式細胞儀的主要測定信號熒光是由激發光激發的，熒光信號的強弱與激發光的強度和照射時間相關，激光是一種相干光源,它能提供單波長、高強度、高穩定性的光照，正是能達到這一要求的理想的激發光光源。

在激光光源和流動室之間有兩個圓柱形透鏡，將激光光源發出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束(22μm×66μm)，在這種橢圓形激光光斑內激光能量成正態分布，使通過激光檢測區的細胞受照強度一致。

光學系統

流式細胞儀的光學系統由若干組透鏡、小孔、濾光片組成，大致可分為流動室前和流動室后兩組。流動室前的光學系統由透鏡和小孔組成，透鏡和小孔（一般為2片透鏡、1個小孔）的主要作用是將激光光源發出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束，使激光能量成正態分布，使通過激光檢測區的細胞受照強度一致，最大限度的減少雜散光的干擾；流動室后的光學系統主要由多組濾光片組成，濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管。濾光片主要有三類：長通濾片（LP）--只允許特定波長以上的光線通過，短通濾片(SP)-- 只允許特定波長以下的光線通過，帶通濾片(BP)-- 只允許特定波長的光線通過，不同組合的濾片可以將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管(PMT),如接收綠色熒光(FITC)的PMT前面配置的濾光片是LP550和BP525, 接收色橙紅色熒光(PE)的PMT前面配置的濾光片是LP600和BP575, 接收紅色熒光(CY5)的PMT前面配置的濾光片是LP650和BP675。見圖12.2光學系統和信號檢測系統示意圖。