流式細胞儀的使用（個人體會）

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流式細胞儀(flow cytometry，FCM)是集激光技術、電子技術、光電測量技術、計算機技術以及細胞熒光 技術、單克隆抗體技術為一體的新型高科技儀器，具有靈敏度高、重復性好、特異性強、方法靈活、分析速度快等優點。我院自2000～2002年用美國BD公司生產的FACSC-ALIBUR流式細胞儀，結合科研醫療開展了淋巴細胞亞群(CD3、CD4、CD8、CD19、CD56)分析、白血病免疫分型、DNA分析、活化淋巴細胞CD25的測定、CD34動態監測等的臨床和科研項目。現將使用流式細胞儀的體會總結如下。

一、流式細胞儀 的基本用途

流式細胞 儀可以同時檢測單個細胞的多種細胞參數。

1.內部參數：前向角光散射(FSC)顯示細胞的大小，側向角光散射(SSC)顯示細胞質的顆粒性。從內部參數可了解細胞的大小、形態、細胞質的顆粒性、色素含量等。

2.外部參數：對細胞的某一待測成分進行特異性熒光標記后進行檢測，包括DNA成分及含量、RNA含量、細胞表面和細胞內的各種抗原、細胞功能活性檢測等，分析范圍很廣且特異性強。流式細胞儀能以每秒鐘數十、數百、數千個細胞的速率進行檢測，測定的細胞總數可達數千、數萬，使得樣本能在較短時間內得到全面和準確結果。

二、樣本的采集和單細胞懸液制備的質量控制

用于流式細胞分析的樣本須是單細胞懸液。

1.血液、骨髓是天然的單細胞懸液，可直接染色分析。標本用肝素抗凝，需在6小時內進行抗體標定染色，時間過長，細胞活性降低，影響分析結果，48小時后的標本無分析意義。有些試驗以某一群細胞為檢測對象，須將所測細胞成分分離出來。本院常用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，制成單細胞懸液。

2.實體組織標本單細胞懸液的制備：取手術切除的新鮮組織的可疑部分用眼科鑷夾取小塊組織置鋼網上輕輕擦磨，同時用PBS緩沖液沖洗，收集沖洗下的單細胞懸液，調細胞濃度至lxl06/ml，經150目尼龍膜過濾、離心，取沉淀物加70%乙醇固定備用。應注意在鋼網上擦磨的過程中，用力要適當，用力過大，對細胞損傷較大，產生大量細胞碎片，影響分析。

三、單細胞懸液熒光染色的質量控制

熒光染色對流式細胞分析關系重大，我科使用的熒光染料有：PE、FTTC、cychrome、PI等，操作時將標本和染色劑加人試管底部，混勻，避光(光亮可造成熒光淬滅)，室溫放置20分鐘，如室溫過低影響染料結合，可適當延長染色時間。血液、骨髓標本染色后經溶血、洗滌、固定過程即可上機。應注意標本和試劑用量很少，不應加到試管壁上，防止標本和試劑不能充分接觸著色。溶血一定要充分，沒有完全溶解的紅細胞及碎片的存在影響檢測分析。

四、上機檢測分析的質量控制

上機獲取前使用BD公司提供的質控微球(calibrate bends)來設置和調節儀器的各種參數于最佳狀態，如設置光電倍增管(PMT)電壓，調節熒光補償，檢測探測器的靈敏度，使儀器的變異系數(CV值)在2%以內。

每一個標本都需同時做一個陰性對照管，由于質控微球和細胞有著不同的光學性質，上述的儀器設置對于生物體標本不一定是最合適的，因此還要用空白標本來調節儀器，使其進一步優化。同時，對空白對照管進行圖像分析，可以了解是否有可能導致錯誤結果的非特異性染色的存在。獲取分析時小心觀察設門情況，即把要分析的細胞設置在門內，盡量減少其他細胞和碎片的摻人，獲取細胞數(每個試驗要求不同)要足夠。