流式細胞儀分析技術及應用

在2019年的三月份我正式開始做單細胞相關研究工作，有趣的同時也是朋友我們經常誤會的是：你是不是用流式細胞術？而我在得知自己要做這單細胞（single cell ）的研究時，在Google搜關鍵詞（single cell ），居然有不少是介紹流式細胞術的。流式細胞術應用到高通量測序領域就變成了微流控技術。可見，把生命科學的視界拉倒單細胞水平的比高通量測序更早的是流式細胞術。

那么在單細胞測序技術出現之前，人們在研究單細胞的時候都是怎么做的呢，都有哪些分析點呢？單細胞測序技術給單細胞研究帶來了哪些新的視角？這一切的答案都要求我們對流式細胞術有一個基本的了解。

流式細胞術(flow cytometry, FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和分選的新技術。

流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發展起來的對細胞的物理或化學性質（如大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術。

采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色性與激發效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析，保證了檢測速度與統計分析精確性。

（1） 液流系統
（2） 光學系統
（3） 數據處理系統

激光光源：氣冷式氬離子激光器
分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長
光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡
透鏡組：形成平行光，除去室內光
濾片：長通、短通、帶通
光電倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）

測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。

熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發后產生，發射的熒光波長與激發光波長不同。
每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區分開，送入不同的光電倍增管。
選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。
線性放大器和對數放大器

通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養和研究時進行的。

FS：反映顆粒的大小
SS：反映顆粒的內部結構復雜程度
FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少

單參數直方圖
雙參數直方圖:點圖
二維等高圖
假三維等高圖
三參數直方圖
多參數分析

雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根據這兩個參數就可以確定細胞在圖上的表達位置。

雙參數信號通常采用對數信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。

由類似地圖上的等高線組成，其本質也是雙參數直方圖。
等高圖上每一條連續曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即“等高”。
曲線層次越高(越里面的線) 所代表的細胞數愈多。
等高線越密集則表示細胞數變化率越大。

流式細胞儀(FCM)是集單克隆抗體、熒光化學、激光、計算機等高技術發展起來的一種先進儀器，已廣泛應用于免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規工作。

①細胞生物學 ：細胞凋亡研究；定量分析細胞周期并分選不同細胞周期時相的細胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表達產物等物質與細胞增殖周期的關系，進行染色體核型分析，并可純化X或Y染色體。 [詳細]

②腫瘤學 ：DNA倍體含量測定是鑒別良、惡性腫瘤的特異指標。近年來已應用DNA倍體測定技術，對白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種實體瘤細胞進行探測。用單克降抗體技術清除血液中的腫瘤細胞。 [詳細]

③免疫學 ：研究細胞周期或DNA倍體與細胞表面受體及抗原表達的關系；進行免疫活性細胞的分型與純化；分析淋巴細胞亞群與疾病的關系；免疫缺陷病如艾滋病的診斷；器官移植后的免疫學監測等。 [詳細]
④血液學 ：血液細胞的分類、分型，造血細胞分化的研究，血細胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等；用NBT及DNA雙染色法可研究白血病細胞分化成熟與細胞增殖周期變化的關系，檢測母體血液中Rh(+)或抗D抗原陽性細胞，以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發生嚴重溶血；檢測血液中循環免疫復合物可以診斷自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡等。 [詳細]

⑤藥物學 ：檢測藥物在細胞中的分布，研究藥的作用機制，亦可用于篩選新藥，如化療藥物對腫瘤的凋亡機制，可通過測DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡調節蛋白等。 [詳細]

細胞凋亡研究 ：細胞凋亡是細胞在基因控制下的有序死亡，在疾病發生、發展中有重要作用，因而研究細胞凋亡有重要意義。細胞凋亡檢測方法很多，應用流式細胞儀技術可根據細胞在凋亡過程中發生一系列形態、生化變化從多個角度對細胞凋亡進行定性和定量的測定。 [詳細]

** 細胞分選**：流式細胞儀能夠分選某一亞群細胞,分選純度＞95%。目前細胞分選主要用于研究，臨床應用較少。利用流式細胞儀分選免疫擔當細胞進行細胞免疫學研究也是目前的熱門課題。流式細胞儀能夠分選出你想得到的任何一亞群細胞，只要你想得到的某一亞群細胞有合適的單克隆抗體標記。 [詳細]

** 細胞因子的檢測**：隨著多標記及胞內細胞因子標記流式細胞技術的出現，使對細胞內細胞因子的研究推向了一個新的階段。本文主要對胞內細胞因子流式細胞技術作介紹。 [詳細]

** 血液學應用**：本文向您介紹流式細胞儀在血液研究領域的應用，包括DNA倍體分析及細胞周期分析，淋巴細胞亞群測定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，紅細胞疾病診斷，血小板功能分析和血小板病診斷，微小殘留白血病檢測，白細胞吞噬功能測定，NK和LAK細胞活性測定，造血干/祖細胞測定等。 [詳細]