流式細胞儀原理及操作步驟

　　流式細胞儀原理及操作步驟：

　　流式細胞儀是集單克隆抗體、熒光化學、激光、計算機等高技術發展起來的一種先進儀器，已廣泛應用于免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規工作。其中檢測人白細胞表面標志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細胞。活細胞免疫熒光技術是用于FCM檢測的標本準備，染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優于滴片固定的常規間接免疫熒光的結果醫學教|育網搜集整理。

　　（一）原理

　　活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。

　　（二）操作步驟

　　制備活性高的細胞懸液（培養細胞系、外周血單個核細胞、胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法）

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　　用10%FCSRPMI1640調整細胞濃度為5×106-1×107/ml

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　　取40μl細胞懸液加入預先有特異性McAb（5-50μl）的小玻璃管或塑料離心管，再加50μl1∶20（用DPBS稀釋）滅活正常兔血清

　　↓4℃30min

　　用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右

　　1000rpm×5min

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　　棄上清，加入50μl工作濃度的羊抗鼠（或兔抗鼠）熒光標記物，充分振搖↓4℃30min

　　用洗滌液洗滌2次醫學|教育網搜集整理，每次加液2ml左右

　　1000rpm×5min

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　　加適量固定液（如為FCM制備標本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細胞濃度加入100-500μl固定液）

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　　FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察（標本在試管中可保存5-7天）