流式細胞儀的參數測量原理

　　流式細胞儀可同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區進行的，所謂測量區就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單個細胞通過測量區時，受到 激光照射會向 立體角為2π的整個空間 散射光線，散射光的 波長和入射光的波長相同。 散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態、質膜和細胞內部結構密切相關，因為這些生物學參數又和細胞對 光線的反射、折射等光學特性有關。未遭受任何損壞的細胞對 光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的 散射光信號對不經染色 活細胞進行分析和分選。經過固定的和染色處理的細胞由于光學性質的改變，其 散射光信號當然不同于活細胞。 散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數相關，還跟散射角、及收集散射光線的 立體角等 非生物因素有關。

　　在 流式細胞術測量中，常用的是兩種散射方向的 散射光測量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②側向散射（SSC），又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集 散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角 散射光的強度與細胞的大小有關，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經實驗表明在小 立體角范圍內基本上和截面積大小成 線性關系；對于形狀復雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側向 散射光的測量主要用來獲取有關細胞內部精細結構的顆粒性質的有關信息。側向 散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關，但它對 細胞膜、胞質、 核膜的折射率更為敏感，也能對 細胞質內較大顆粒給出靈敏反映。

　　在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒光探針聯合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。

　　熒光信號主要包括兩部分：①自發熒光，即不經熒光染色細胞內部的 熒光分子經光照射后所發出的熒光；②特征熒光，即由細胞經染色結合上的 熒光染料受光照而發出的熒光，其熒光強度較弱， 波長也與照射激光不同。自發熒光信號為噪聲信號，在多數情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在 免疫細胞化學等測量中，對于結合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關鍵。一般說來，細胞成分中能夠產生的自發熒光的分子（例核黃素、 細胞色素等）的含量越高，自發熒光越強；培養細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發熒光越強。

　　減少自發熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的 熒光染料；②選用適宜的激光和濾片 光學系統；③采用電子補償電路，將自發熒光的本底貢獻予以補償。