流式細胞儀在醫學研究與檢驗工作中的應用(2）

　22流式細胞儀在腫瘤學中的應用

　　FCM對DNA、RNA含量及細胞周期的分析具有獨到之處。人體正常的體細胞均有較恒定的DNA二倍體含量，細胞癌變過程中伴隨細胞DNA含量的改變，DNA非整倍體細胞是惡性腫瘤的特異性標志。根據DNA分布直方圖，可對細胞周期的分布狀態進行分析，計算出G0/G1比率,S相/(G2+M)比率并了解細胞的增殖能力，在腫瘤病理學研究中，通常以S期比率(S-phase fraction,SPF)作為判斷腫瘤增殖狀態的指標。此外，DNA指數對腫瘤的早期診斷、鑒別診斷、判斷預后及評價療效有重要意義［4，5］。

　　221在腫瘤早期診斷中的應用大量工作表明，癌前病變的癌變率與病變的增生程度一致，而增生程度與DNA含量的異常改變又呈平行關系。FCM通過精確定量DNA含量，能對癌前病變的性質和發展趨勢作出判斷，有助于癌前病變的早期判斷。Barrett食管是食管癌的癌前病變之一，Montgomery等用FCM技術對58例Barrett食管進行了分析，發現DNA非整倍體中有77%為高度不典型增生［6］。對于造血系統惡性腫瘤的早期診斷，形態學上一般不具有典型的特征，應用FCM的DNA倍體檢測可解決這一問題。Wantzin等曾對7例早期T細胞性淋巴細胞瘤的活體標本進行DNA分析，發現這7例患者的DNA均為非整倍體，而5～12個月后，病理結果才能診斷為淋巴瘤。故認為FCM對淋巴瘤的早期診斷較之形態學方法更為敏感，準確，它可以測得正常細胞與異常細胞間的微小差異，在形態學還不能作出診斷以前，就可以提供確切的疾病信息［6］。

　　222作為判斷良性或惡性間葉組織腫瘤的輔助指標目前，病理學尚不能證實為惡性的交界瘤，經FCM檢測出DNA非整倍體細胞時可考慮為惡性腫瘤，而病理學認為兩性的腫瘤經流式細胞儀測出非整倍體則提示有惡性轉變的可能。

　　223DNA異倍體與惡性腫瘤預后的關系用FCM分析DNA含量和DNA倍體及S期分析能判斷腫瘤患者的預后。通常認為 DNA含量高，非整倍體的腫瘤惡性程度高，預后差，而二倍體或近二倍體腫瘤預后則較好。同時，SPF在估計腫瘤的惡性程度和預后方面也有重要意義。

　　23流式細胞儀在研究細胞凋亡中的作用

　　研究細胞凋亡的方法有幾種：

　　①形態學上的電子顯微鏡檢測可區分細胞凋亡和壞死；

　　②對細胞凋亡的生化特征進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳可見特征性的梯狀帶；

　　③FCM檢測凋亡細胞是結合了形態學檢測、生化改變及DNA含量變化、細胞膜磷脂分布的改變及DNA斷裂點標記等幾方面。FCM應用于凋亡形態學時，主要是根據細胞凋亡時出現細胞膜皺縮，胞漿濃縮，體積減少；因此檢測時前向角散射光(forward scatter, FSC)下降，而側向角散射光(side scatter, SS)增加，但這種表現只出現于凋亡最早期，所以，形態學檢測一般用于凋亡早期。

　　FCM應用于凋亡較廣泛的方法是DNA含量分析。在凋亡過程中，DNA降解，凋亡小體帶走部分DNA，造成核內DNA含量下降；在DNA熒光標記時，其染色能力下降，在G1峰前呈現亞二倍體峰，稱亞G1期峰。此法的最大優點在于獲得凋亡細胞百分數的同時可以與細胞周期中其他時相的細胞進行比較。

　　檢測凋亡較特異的方法可能是對DNA斷裂點進行標記后FCM檢測。細胞凋亡的最后階段是形成DNA斷片。檢測 DNA斷片的方法是DNA聚合酶催化的原位缺口轉移(in situ nick translation,ISNT)或TdT接到的dUTP原位缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dTUTP nick end labeling TUNEL)技術。ISNT和TUNEL法均可進行間接或直接標記［7］。其優點是：觀察細胞數量大，避免由于細胞過少引起的偏差；設立陰性對照，能較客觀地檢測凋亡細胞群體；可進行凋亡與其他相關因素的聯合檢測。它較病理學檢測，用時短，簡便。

　　在細胞凋亡過程中，半胱氨酰基天冬氨酸蛋白酶家族（caspases）在凋亡早期才能檢測到，在凋亡過程中持續升高，凋亡晚期快速下降，通過FCM 對caspases-3的檢測，可動態觀察凋亡的全過程。此外，可利用細胞凋亡時膜內側的膜磷脂酚絲胺酸(PS)由膜內側翻轉到膜外的特征進行檢測。將熒光標記的親PS的檢測探針 Annexin-V與PI聯合標記染色，AV與處于細胞外環境的PS結合。由于早期凋亡細胞膜完整，PI不能通過完整的細胞膜，因此可定量檢測早期凋亡細胞（V-FITC+/PI-群）及壞死細胞(V-FITC-/PI-群)［8］。