流式細胞儀在血液學檢驗中的應用

 摘要：流式細胞儀(flow cytometer，FCM)是一項集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、計算機技術以及細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的新型高科技儀器。在醫學研究領域中，流式細胞儀能夠快速分析單個細胞的多種特性，它既可以定性也可以定量，適于大量標本的檢測。

       1973年，美國BD公司與美國斯坦福大學合作，研制開發并生產了世界第一臺商用流式細胞儀FACS I。進入90年代，流式細胞術作為一門生物檢測技術已經日臻完善，隨之而來的就是應用領域的日趨廣泛。由于FCM標本要求是單細胞懸液，而血或骨髓有取材方便、利于系列追蹤疾病發展等天然優勢，因此FCM在血液學中的應用尤為廣泛。

       1、流式細胞儀的工作原理

       流式細胞儀的結構一般可分為5部分：

       ①流動室及液流驅動系統；

       ②激光光源及光束成形系統；

       ③光學系統；

       ④信號檢測與存貯、顯示、分析系統；

       ⑤細胞分選系統。

       流式細胞儀可以檢測單個細胞的可見光和熒光特性。通過檢測細胞大小和內容物等物理特性可以對細胞進行分群。熒光染料可以連接或插入到DNA、RNA等細胞內容物中。另外，熒光染料連接的抗體能夠與細胞膜上或其內部的特異蛋白結合。當標記細胞通過光源時，熒光分子被激發到較高的能級。當其回到基態后，熒光染料在較長的波長上釋放光能。使用具有相似激發波長、不同發射波長的多種熒光染料，可以同時檢測幾種細胞特性。

       在流式細胞儀內，待測細胞在鞘液包裹下單行排列，依次通過檢測區域。流式細胞儀通常使用激光作為激發光源，激發光向各個方向散射，通過一系列的濾光片和雙色性反光鏡的分離，形成不同波長的熒光信號。光信號經光電倍增管接收后轉換為電信號，經數／模轉換器轉換為可被計算機識別的數字信號。檢測數據可以以直方圖和二維散點圖表示出來。

   2、FCM在血液學中的應用

       2.1 用于血液／腫瘤細胞增殖動力學研究    細胞經DNA熒光染料如碘化丙啶(PI)、溴化乙啶(EB)、Hoechst等標記后，FCM可測定單個細胞DNA的含量，并描繪出DNA圖形，經軟件處理可計算出Go/Gi、S、G2/M各細胞周期細胞所占的百分比。依據增殖指數可了解群體細胞的增殖活力。焦寧Y與FITC分別是RNA與蛋白質的特異性染料；PI與FITC雙染可測知單個細胞內DNA與蛋白質量的變化；丫啶橙(AO)染色法不僅可測定單個細胞DNA與RNA含量，還可區分出Go與G1期細胞；若丹明123(rhodamin 123)是線粒體特殊染料。通過以上各種特殊染色法，不僅可了解血／腫瘤細胞的增殖狀況，更可用于化療藥物作用機制的探討，從而將其區分為增殖周期特異性、非特異性藥物，以及周期時相特異性、非特異性藥物，以便更合理的配伍聯合化療方案，預測腫瘤細胞對藥物的敏感性等。

       單參數DNA圖形或AO染色DNA/RNA雙參數法可顯示非整倍體峰，理論上其靈敏度達萬分之一。非整倍體細胞是腫瘤細胞的特異標志，在實體瘤中檢出率為80% - 90%，在白血病中約為30% - 40%。非整倍體細胞克隆在腫瘤完全緩解期消失，復發前重現。因而FCM-DNA非整倍體測定在腫瘤的診斷、殘存腫瘤細胞監測及預示預后中有重要價值。

       用抗5-溴脫氧尿嘧啶核苷單抗法可測定細胞倍增時間與各時相時間，用抗周期蛋白單抗可研究周期蛋白對細胞周期的調控。

   2.2 用于白細胞檢測

       2.2.1 白血病或淋巴瘤免疫分型

       雖然至今尚未發現白血病或淋巴瘤的特異抗原，更沒有各亞型的特異抗原，但根據分化阻抑學說，在白血病或淋巴瘤中，某系列、某分化階段的細胞必然大大超過正常比例，因此可以利用正常血細胞系列的特異性及分化階段特異單抗來進行分型。

       FCM免疫分型有以下優點：

       2.2.1.1 形態學檢查的可靠性取決于檢查者的經驗，而FCM則是根據特異性單抗客觀、快速地確定細胞的來源與性質。比如，FCM可以判斷形態學難以分辨的髓系細胞和淋巴細胞，可以分辨T及B淋巴細胞，即FCM免疫分型法可明確區分粒細胞和淋巴細胞白血病，以及T細胞和B細胞性白血病或雜合性白血病。

       2.2.1.2 對于急性粒細胞白血病亞型的診斷，單純FCM免疫分型還難以得出肯定的結論，但可提供傾向性參數。比如，CD34+，HLA-DR+者以FAB-M2或M1型可能性大；兩者均陰性且CD33+、CD13+者多為FAB-M3型；CD14，CD41則分別是單核細胞與巨核細胞的標志。

       2.2.1.3 多色熒光標記法可測知一個細胞上是否有共表達的抗原，借此可確定雙克隆或雙表型白血病。

       2.2.1.4 聯合使用免疫熒光與DNA雙染色法，對有非整倍體者可確定其克隆來源。

       基于上述優點，FCM-免疫分型已成為診斷白血病、淋巴瘤的必要依據。然而血、腫瘤細胞的特性決定了其表型的異質性，因此當出現髓系與淋巴系標志共存時，難以確定是白血病的異質性還是雜合性白血病，但是這種特殊表型可作為殘存白血病細胞的標志。

       2.2.2 用于白細胞分類計數和白血病形態學的分型

       電阻抗法白細胞“分類”只是根據加入溶血劑后，變化了的白細胞形態的大小。根據電信號進行分析，其只是根據細胞體積大小不同的特征，并未分析細胞核、漿形態特點。因此只能是細胞大小的“分群”而不是分類。

       流式細胞術是通過激光檢測細胞，激光束可直接射入細胞，細胞的核、漿特征不同，給予的檢測信號不同，因而可較準確的進行細胞分類。除此以外，有些儀器還可以分析幼稚白細胞，甚至進行白血病分型的初步分析。比如筆者研究證明ADVIA 120血細胞分析儀因為使用細胞化學和激光兩種技術進行綜合分析，就可以用末梢血（白血病細胞比例> 70%）進行以儀器分析，根據報告的散點圖，初步診斷出是淋巴細胞白血病和髓細胞白血病。

       2.3 免疫功能測定

       常用的測定是CD3，CD4，CD8，T，B細胞的比例及NK細胞(CD56，CD18)。CD5+B細胞在免疫10 ZHONGGUOYIXUEZHUANGBE性疾病、膠原性疾病中起重要作用；CD4+細胞絕對值小于400/ml是AIDS病的早期表現。

   2、FCM在血液學中的應用

       2.1 用于血液／腫瘤細胞增殖動力學研究    細胞經DNA熒光染料如碘化丙啶(PI)、溴化乙啶(EB)、Hoechst等標記后，FCM可測定單個細胞DNA的含量，并描繪出DNA圖形，經軟件處理可計算出Go/Gi、S、G2/M各細胞周期細胞所占的百分比。依據增殖指數可了解群體細胞的增殖活力。焦寧Y與FITC分別是RNA與蛋白質的特異性染料；PI與FITC雙染可測知單個細胞內DNA與蛋白質量的變化；丫啶橙(AO)染色法不僅可測定單個細胞DNA與RNA含量，還可區分出Go與G1期細胞；若丹明123(rhodamin 123)是線粒體特殊染料。通過以上各種特殊染色法，不僅可了解血／腫瘤細胞的增殖狀況，更可用于化療藥物作用機制的探討，從而將其區分為增殖周期特異性、非特異性藥物，以及周期時相特異性、非特異性藥物，以便更合理的配伍聯合化療方案，預測腫瘤細胞對藥物的敏感性等。

       單參數DNA圖形或AO染色DNA/RNA雙參數法可顯示非整倍體峰，理論上其靈敏度達萬分之一。非整倍體細胞是腫瘤細胞的特異標志，在實體瘤中檢出率為80% - 90%，在白血病中約為30% - 40%。非整倍體細胞克隆在腫瘤完全緩解期消失，復發前重現。因而FCM-DNA非整倍體測定在腫瘤的診斷、殘存腫瘤細胞監測及預示預后中有重要價值。

       用抗5-溴脫氧尿嘧啶核苷單抗法可測定細胞倍增時間與各時相時間，用抗周期蛋白單抗可研究周期蛋白對細胞周期的調控。

   2.2 用于白細胞檢測

       2.2.1 白血病或淋巴瘤免疫分型

       雖然至今尚未發現白血病或淋巴瘤的特異抗原，更沒有各亞型的特異抗原，但根據分化阻抑學說，在白血病或淋巴瘤中，某系列、某分化階段的細胞必然大大超過正常比例，因此可以利用正常血細胞系列的特異性及分化階段特異單抗來進行分型。

       FCM免疫分型有以下優點：

       2.2.1.1 形態學檢查的可靠性取決于檢查者的經驗，而FCM則是根據特異性單抗客觀、快速地確定細胞的來源與性質。比如，FCM可以判斷形態學難以分辨的髓系細胞和淋巴細胞，可以分辨T及B淋巴細胞，即FCM免疫分型法可明確區分粒細胞和淋巴細胞白血病，以及T細胞和B細胞性白血病或雜合性白血病。

       2.2.1.2 對于急性粒細胞白血病亞型的診斷，單純FCM免疫分型還難以得出肯定的結論，但可提供傾向性參數。比如，CD34+，HLA-DR+者以FAB-M2或M1型可能性大；兩者均陰性且CD33+、CD13+者多為FAB-M3型；CD14，CD41則分別是單核細胞與巨核細胞的標志。

       2.2.1.3 多色熒光標記法可測知一個細胞上是否有共表達的抗原，借此可確定雙克隆或雙表型白血病。

       2.2.1.4 聯合使用免疫熒光與DNA雙染色法，對有非整倍體者可確定其克隆來源。

       基于上述優點，FCM-免疫分型已成為診斷白血病、淋巴瘤的必要依據。然而血、腫瘤細胞的特性決定了其表型的異質性，因此當出現髓系與淋巴系標志共存時，難以確定是白血病的異質性還是雜合性白血病，但是這種特殊表型可作為殘存白血病細胞的標志。

       2.2.2 用于白細胞分類計數和白血病形態學的分型