流式細胞儀檢測實驗TUNEL組織切面的凋亡細胞的原位雜交

要分析的新鮮組織

含1% （m V)多聚甲醛的PBS (低溫攬拌溶解過夜用之前過濾)Tris緩沖鹽（TBS)含 0.1% (V V) H2O2 的 TBSTdT反應液TdT 地高辛（digo×igenin下同）-dUTP混合液2% (V V)馬血清或含FBS的TBS羊抗地高辛初級抗體溶液HRP共軛的抗羊二級抗體溶液AEC底物工作液Mayer 蘇木精

Crystal Mount 封固介質疏水的棚欄載玻片標志（如 PAP Pen)Coplin廣口瓶或染色托盤加濕箱

1) 準備5?8μm的冰凍切片，室溫過夜晾干載玻片。石蠟切片也可以用；切片應該事先制備，水化，然后真空干燥。

2) 用PAP筆在每個切片周圍的玻璃上劃一條疏水界線。

3) 用1%多聚甲醛完全覆蓋整個切片，在一個密閉的箱內室溫孵育30 min。

4) 倒掉多聚甲醛，洗滌載玻片在含TBS的廣口瓶或含染色托盤內室溫孵育5 min，在孵育過程中，載玻片從該溶液浸入、取出3?4次。

5) 用含0.1%(V/V) H₂O₂的TBS覆蓋切片。置一個密閉箱室溫孵育30 min,以猝滅內源的過氧化物酶活性。

6) 按照步驟4用TBS洗滌，用TdT反應液覆蓋切片，以沖洗掉TBS。

7) 盡可能地去除反應液，加入25μL的TdT/地高辛-dUTP混合液。在加濕箱內37℃ 解育45?60 min。

8) 用TBS洗滌載玻片一次，然后用2%馬血清或含FBS的TBS洗一次，洗滌過程參照步驟4。

9) 用羊抗地高辛初級抗體溶液覆蓋切面，在一個密閉箱內室溫孵育1 h。

10) 按步驟8洗滌載玻片，然后用HRP共扼的抗羊二級抗體溶液覆蓋切片，密閉箱內室溫孵育1 h。

11) 按步驟8洗滌載玻片，然后用AEC底物工作液覆蓋切片，室溫孵育10?20 min。

12) 按步驟8洗滌載玻片，在Mayer蘇木精里孵育0.5?1 min復染。然后用自來水在 Coplin廣口瓶內洗漆5 min。

13) 擦去切片周圍多余的水，用Crystal Mount封固蓋玻片。