流式細胞儀檢測益肺清化顆粒對荷瘤小鼠瘤組織E-cad CD44v6表達水平的影響

益肺清化顆粒是樸炳奎主任醫師積多年的臨床經驗，并經國家“七五”攻關進一步開發，研制出的治療肺癌的有效方藥，已經上市近10年。經臨床和基礎研究證實，該藥可抑制病灶進展，有效延長患者的生存期。現選取該藥對肺癌侵襲轉移過程中黏附分子表達水平的影響，以深入探討該藥的作用機制，更好地指導臨床用藥。

1、材料與方法

1.1儀器 FACSort 流式細胞儀（FCM），美國Becton-Dicknson公司；離心機himacCF1502，日本HITACHI。

1.2 試劑 CD44v6分子，boster公司，編號：BA0454；
　　上皮型鈣黏附分子（E-cadherin，簡作E-cad）boster公司，編號：BA0475；抗免IgG-FITC熒光標記二抗，美國Sigma公司，編號：F9887；P.B.S 0.01M pH7.2～7.4磷酸鹽緩沖液，美國Gibo公司；PFA：paraformaldehyde 多聚甲醛，美國Sigma公司。

1.3 藥物 環磷酰胺注射液（CTX）：上海華聯制藥，批號：20030815。

1.4實驗方法

　　藥物用法 肺瘤平膏：根據人與小鼠體表面積比系數折算，相當于人等效劑量的5倍，每天1 次，灌胃給藥，連用15天；CTX每次60mg/Kg體重，腹腔注射給藥，分別于第3、7、11、15天給藥1次。空白對照組予潔凈自來水灌胃，每天1次，連用15天。

　　標本制備

　　動物：C57BL/6小鼠，雄性，體重18～22g，二級動物房，常規飼養，由中國醫學科學院實驗動物中心提供，合格證編號：01-3001。

　　瘤源及方法：Lewis肺癌瘤株，由醫科院藥物所提供。移植后10天，選擇表皮無破潰，腫瘤生長良好的荷瘤小鼠，無菌取瘤組織，去掉瘤組織周圍脂肪、筋膜等軟組織，用無菌生理鹽水沖洗3次，稱重，剪成小塊，研磨，按1：3用生理鹽水稀釋，細胞濃度約為1×107/ml，每只小鼠0.2ml接種于小鼠右上肢腋部皮下組織。

　　C57BL/6小鼠45只，隨機分為中藥組、CTX組及空白對照組。每只小鼠均右側腋窩皮下接種腫瘤勻漿液0.2ml/鼠。第2天開始灌胃給藥，連續15天，CTX線腹腔注射給藥。第21天頸椎脫臼處死動物，結束實驗。

　　流式細胞儀檢測流程：處死小鼠，取瘤組織，稱重，生理鹽水沖洗；于100目不銹鋼濾網上加2ml生理鹽水研磨，形成單細胞懸液，瘤液移入試管內，離心（1000r/min），去上清；加入2ml蒸餾水1min并加入4ml1.8%高滲鹽水，混勻后即離心（1000r/min）5min，去上清；加PBS4ml離心（1000r/min）5min×2，去上清；加PBS2ml，吹打，分裝，每管200μl（腫瘤細胞數約在1×106/ml）離心，去上清；加一抗50～100μl（對照組加等量PBS），4℃孵育30min，1mlPBS，離心，去上清×2；加50μl二抗（熒光抗體）， 4℃孵育30min（染色在暗處進行），1mlPBS，離心，去上清，重復1次；加0.8～1ml1%PFA 4℃保存，可于3～4天內上機檢測。

　　檢測方法 測定采用美國BD公司出品FACSort流式細胞儀。校正機器后，先設定收集門，以固定條件收集樣本。每個樣品管收集104個細胞后進行分析。采用Macintosh Ouadra650計算機和CellQuest軟件收集處理樣品數據。機器測試條件為FSC電壓E-1，增益6.72；SSC電壓335mV。

1.5統計學方法 采用SPSS10.0軟件進行統計。

2、結果

流式檢測結果顯示：中藥治療后瘤組織內的E-cad水平呈高表達狀態，陽性表達率達14.77%，優于CTX組內6.16%和對照組2.75%的表達水平。其中中藥組與對照組的表達水平比較有非常顯著的差異（P<0.01）；CTX組與中藥組比較差異不明顯。

中藥治療后瘤組織內的CD44v6水平呈低表達狀態，陽性表達率為3.73%，弱于CTX組10.8%和對照組13.48%的表達水平。其中中藥組與對照組的表達水平相比較，有較為顯著的差異（P<0.05）；CTX組與中藥比較差異不明顯。見表1

表1 E-cad、CD44v6在腫瘤細胞的表達結果（±s）

注：與對照組比較，※P<0.05，※※P<0.01。注：與對照組比較，※P<0.05，※※P<0.01。

3、討論

3.1 肺瘤平膏（上市前名為：肺瘤平膏）以近年常用的方劑為依據擬定，選藥遵從中醫理論的指導，并選用了現代科學實驗證實有抑瘤作用的藥物。功能為：益氣養陰，清熱解毒，兼化痰止咳。藥物為：黃芪、黨參、沙參、麥冬、桔梗、紫菀、拳參、仙鶴草、白花蛇舌草等。

方中黃芪補肺氣之不足，黨參、甘草補脾和中護胃，沙參、麥冬養肺胃之陰，紫菀、桔梗等利肺降氣，化痰止咳，兼以引藥入肺經，拳參、仙鶴草、白花蛇舌草等有抑制腫瘤的作用。

臨床治療195例晚期原發性肺癌患者，且與144例化療病人對照觀察療效發現：較之化療，肺瘤平膏可有效改善患者咳嗽、痰量、胸痛、氣短、乏力等癥狀，可有效增強體質、提高生存質量、穩定病灶、延長生存期，且無明顯毒副作用。

目前已知腫瘤的浸潤和轉移與期黏附分子表達的改變有關。一方面，腫瘤細胞某些黏附分子表達的減少可以使細胞間的附著減弱，腫瘤細胞脫離并與周圍細胞的附著，這是腫瘤浸潤及轉移的第一步；另一方面，腫瘤細胞表達的某些黏附分子使已入血的腫瘤細胞得以黏附血管內皮細胞，造成血行轉移。

近幾年國內處研究認為E-cad介導Ca++依賴性的同種細胞之間的黏附，在維系癌細胞的上皮形態和功能方面起著某種關鍵性作用。E-cad屬于侵襲抑制因子，E-cad基因屬轉移抑制相關基因，其通過促進同質細胞間的黏附，使腫瘤細胞之間保持密切接觸，難以脫離原發瘤進入周圍組織和血管。

E-Cadherin分子表達水平降低與腫瘤細胞惡性程度顯著相關，且E-Cadherin分子與腫瘤浸潤能力呈負相關。大量的資料顯示，E-Cad及其相關蛋白表達與肺癌侵襲與轉移機制關系密切，并可能成為判斷肺癌治療效果和預后的可靠指標之一。

轉移性腫瘤細胞與血管內皮結合后，還必須黏附并浸潤到內皮下基底膜和ECM，，CD44分子在此過程中起著重要的作用。不同的CD44分子在腫瘤浸潤與轉移過程中的作用可能是不同的，正常組織細胞或非轉移的癌細胞主要表達CD44，而具有轉移能力的癌細胞主要表達CD44V。其表達的持續性和嚴重程度在進行腫瘤診斷和預后具有重要的意義。

CD44基因表達與腫瘤的生長、浸潤、轉移關系密切。研究認為，CD44V6變異體可能通過促進癌細胞與血管內皮和ECM的黏附促進腫瘤向基質侵襲，從而影響腫瘤細胞的遷移和運動能力，也有研究認為，CD44V6可能通過影響癌細胞的骨架構象和分布，從而影響癌細胞的運動能力和癌轉移。

3.2 結論 實驗使用流式細胞儀檢測了用藥后荷瘤小鼠體內移植的Lewis腫瘤細胞表達E-cad、CD44V6的情況。研究證實，肺瘤平膏可有效地提高E-cad、CD44v6的情況。研究證實，肺瘤平膏可有效提高E-cad、CD44v6的表達水平。對照組CTX對E-cad、CD44v6的作用不肯定。

其抗腫瘤作用的機制，考慮與提高E-cad的表達水平，從而增加腫瘤細胞間粘附能力，降低腫瘤細胞脫落進入周圍組織和血管的機率；同時，肺瘤平膏尚可降低CD44v6的表達水平。

可能通過減弱腫瘤細胞與血管內皮和ECM間的異質粘附，降低腫瘤向基質侵襲，影響腫瘤細胞的遷移和運動能力，或可能通過影響癌細胞的骨架構象和分布，從而影響癌細胞運動能力來發揮抗腫瘤的目標的。

但本研究尚屬于較為初步的研究，更為深入的機理研究有待下一步繼續進行。