流式細胞儀檢測細胞凋亡實驗protocol

　　40年來，流式細胞術一直由多色流式主導。 盡管Fulwyler發明的初代儀器基于庫爾特體積，但熒光在短短幾年內成為流式細胞儀主導技術。 從20世紀80年代初到現在，技術開發人員一直致力于構建能夠測量更多熒光參數（我們通常將其稱為“顏色”）的儀器。

　　最開始，G?hde在1968年首次發表關于熒光流式細胞儀的論文，緊隨其后的是來自洛斯阿拉莫斯的van Dilla的報道，兩者都測量了一個熒光信號。 在之后的10年內，Mike Loken將可測量參數擴大到了兩個，并證明雙參數具有更大的優勢，于是，流式細胞儀領域從單參數開始進入多參數時代。 最早的三色流式細胞儀出現在20世紀80年代初期，之后在幾年內三色流式細胞儀就開始流行，到了20世紀90年代中期，三熒光參數流式細胞儀已是司空見慣了，并自然而然地出現了四色流式，隨之，立即出現了補償問題。自此之后，補償就成了流式細胞儀每個檢測都需要解決的問題，也成了每場研討會都需要重復的經典話題。 然而，補償仍無法簡單地解決，還是需要大量的經驗和精力去對付。

　　在20世紀90年代，增加流式細胞儀的參數數量，很明顯是為了發現生物學更深層次的機制。流式細胞術應用的最終目標就是在單細胞水平上發現細胞受體和功能之間直接和決定性關系，雖然我們已經具有前向和側向散射光參數，這兩個參數跟熒光也有關聯性，但是添加更多熒光參數能提供直接相關的關系，這些關系無法通過諸如光散射之類的信號識別的。

　　Mario Roederer和他的團隊是引領多色流式的先鋒，在1997年之前開始用8色流式，到2001年用11色，到2004年用17色。2004年至今，參數數量穩定增加到27～30色。

　　回顧過去，流式細胞儀從1參數發展到30參數技術花了50年時間，其中一個重要原因是硬件的復雜性。基本上，12色流式細胞儀就得需要12-14個獨立檢測器和40多個光學過濾器，目前高端的30熒光參數流式細胞儀則需要32個獨立的探測器（加上電源和前置放大器）和大約50到60多個額外的光學元件。因此復雜性和成本是顯而易見的。

　　但問題是為什么許多制造商的持續發展方向都集中在傳統的多色和大量過時的檢測方法上呢？那些舊的光電倍增管（PMT）技術、舊的濾光片技術，最糟糕的是，舊的補償技術并沒法推進流式細胞術的發展，反而是阻礙。

　　有一種替代方案，既可克服補償難題，又使得儀器成本僅有原來成本的五分之一，這就是光譜流式細胞術。 我們小組于2004年在國際分析細胞學會（即ISAC）大會上首次提出功能性光譜流式細胞儀檢測，然后，在同年16年的Photonics出版物中提出了這一點，隨后在2007年Purdue大學獲得了ZL。當時的方法原理是使用連接到色散元件的32通道PMT陣列，硬件組件減少到幾個光學器件和一個探測器陣列。我走遍了世界、推廣這項技術并向NIH申請撥款，以獲得資金開發光譜流式細胞儀技術。 美國國立衛生研究院的審查人員認為這是一個荒謬的想法，并拒絕提供資金，盡管有明確證據表明光譜流式細胞儀不僅可行而且具有科學用途。

　　2011年，索尼獲得了Purdue大學的光譜技術ZL，并開始開發光譜流式細胞儀。 幾年內，多份出版物展示了> 10色光譜流式細胞儀，隨后，使用光譜分離，光譜細胞儀已經實現了超過20色的流式細胞儀，具有優異的結果。 實際上，光譜流式細胞儀的目標是將我們關注的焦點從信號強度轉移到光譜特征作為最重要的參數。 長期以來，我們一直認為“亮度”是信號最重要的特征，我們忽略了光譜特征的功效。 光譜流式細胞儀可以分析多色流式細胞儀無法充分分離的熒光染料，這是非常重要的。

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　　我最近被問到一個問題，為什么光譜流式細胞儀不是流式細胞儀的前沿和中心。 答案很簡單。 多色流式的熒光補償概念根深蒂固，很多用戶向光譜流式轉化看起來太痛苦。 我不斷提出這樣的問題：“當我們有機會去除流式細胞儀的這個邪惡的Bug時，為什么我們還要花費這么多時間和精力專注于補償呢？” 一個又一個教程，一篇又一篇Paper，一個又一個問題。痛苦難道是流式細胞術的必要組成部分嗎？

　　流式中文網注：看到這句話，不僅想插一句，同樣，分析也是令很多FLOWER痛苦的一件事情，我們在5月11日昆明線下聚會（報告今天凌晨已截止）發布的流式智子，也是希望能夠解除這個痛苦，讓分析變得像游戲那樣快樂。下面來一幅流式智子的免疫分型實例結果圖片（點擊放大看原圖），珍愛人生，遠離手工設門：圖片

　　光譜流式細胞儀最終將取代多色流式細胞儀。 這不是問題，而是什么時候。 沒有人聲稱光譜流式細胞儀沒有挑戰，每種技術都有優點和缺點。 但事實仍然是流式細胞術是一種基于光譜學的技術。 目前的流式細胞儀是光譜學領域中最先進的技術，有足夠的擴展能力，有讓人興奮未來。 是時候改變了。