流式細胞儀檢測細胞凋亡

細胞凋亡的檢測方法眾多，流式細胞儀檢測凋亡，是常用的方法。由于流式細胞儀固有的特點――可以準確的進行凋亡細胞的計數。因此，具有其它方法無可比擬的優越性。下面我們就簡單明了地介紹流式在檢測凋亡方面的應用。

在凋亡誘導劑的作用下，首先是細胞色素C和apa f-1形成復合體，線粒體的功能發生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰絲氨酸外翻，這時細胞的形態已經發生了改變，可以看到細胞變小，胞核皺縮；最后是細胞內DNA斷裂，形成凋亡小體。

在凋亡發生的各個過程當中，都有相應的流式細胞儀的檢測方法，可以采用以下檢測方法：

1、線粒體功能

2、DNA Cycle

3、Caspases

4、Annexin V Assay

5、DNA Fragmentation Assays

基本上涵蓋了細胞凋亡的各個期，對各種檢測方法的原理和特點做一個簡單介紹。

線粒體功能檢測的試劑盒有深圳達科為公司代理的試劑盒（產品編號為BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert試劑盒。其檢測主要采用陽離子型熒光染料。

原理是：正常細胞中，染料可以在線粒體內聚集，發出明亮的紅色熒光；而細胞凋亡后，其線粒體膜電位發生改變，染料無法進入線粒體，只能在胞質中以單體形式存在，發出綠色的熒光。可以在熒光顯微鏡下，或流式檢測。采用488nm激發，其檢測波長分別是527nm和590nm。整個實驗過程操作簡單，只需要30min就可以見到結果。

Caspase家族可以檢測的分子非常多，也有不少商業的試劑盒可以應用。即使沒有相應的試劑盒，只要有相應抗體基本上是可以檢測的，具體的方法是參照細胞內蛋白檢測的步驟。

在細胞凋亡過程中伴隨著一系列的形態特征改變，細胞膜的改變是這些特征中較早出現的一種。在凋亡細胞中，細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的外側。Annexin-V是一種35-36KD的鈣粒子依賴的磷脂結合蛋白，它對PS具有較高的親和力。細胞凋亡時，可以和外翻的PS結合，從而可以檢測凋亡的細胞。發生死亡的細胞其細胞膜上的PS也外翻，因而也會陽性。因此，常用的凋亡試劑盒除了采用Annexin-V標記之外，還會加一種DNA染料，常用的有PI和7-AAD，由于死亡的細胞膜通透性增高，染料可以進入細胞內和DNA結合，從而可以發熒光，區分出死細胞。

下圖給出的是在使用FAS單抗誘導前后的檢測結果，橫坐標是Annexin-V FITC，縱坐標是PI，左上、右上、左下、右下四個象限中右上象限代表死亡的細胞，左下象限是存活的細胞，右下象限是凋亡的細胞。

在采用Annixin V方法檢測凋亡細胞時，要特別強調一點：該方法適用于懸浮生長的細胞，如：淋巴細胞等細胞的檢測。對于貼壁生長的細胞，由于在胰酶等消化處理過程中會造成細胞膜的損傷，會造成較高的假陽性，從而影響檢測結果。盡管目前，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細胞。我不推薦用該方法檢測。因為其重復性較差，且需要操作時非常小心。

DNA周期檢測原本是用來反應細胞各個期，即細胞增殖狀況的。利用細胞內DNA能夠和熒光染料，如PI結合的特性。細胞各個時期由于其DNA含量不同從而結合的熒光染料不同，流式檢測的熒光輕度也不一樣。G2-M期DNA含量是G0-G1的兩倍，而S期介于兩者之間。

但是由于發現凋亡的細胞DNA含量較少，因而可以在細胞G0-G1期前面有一個亞二倍體峰，從而認為是凋亡細胞。但是由于死亡的細胞本身其DNA含量也是減少的，因而非常難于區分凋亡和死亡的細胞。在90年代，該方法曾經風靡一時，現在看來，那時的實驗結果需要推敲。盡管，經典的流式檢測資料給出的圖是認為凋亡的細胞是緊挨著G0-G1期峰的一個峰，死亡的細胞峰離G0-G1期峰較遠，但是這種典型的結果似乎很難獲得。有其它的替代方法，完全可以不用這種方法。

晚期凋亡的細胞由于DNA的斷裂，因而可以出現DNA ladder，從而也就有了經典的檢測方法TUNEl。流式也能進行Tunel檢測，其檢測原理與經典Tunel原理基本一致。

以BD公司的為例，其利用TdT能將熒光素標記的dUTP標記到斷裂的DNA末端，從而使凋亡的細胞具有熒光。但是由于在細胞內標記，細胞需要進行固定處理，操作類似免疫組織化學法，容易造成假陽性。建議采用原裝大廠的試劑盒，并且嚴格的設立對照。經過預實驗方法穩定后再進行大規模實驗。標本處理后，均可以用熒光纖維鏡進行觀察，拍照。流式檢測后，可以進行精確的計算凋亡百分比。這一點，經典TUNEl是做不到的。