流式細胞分析

實驗概要

流式細胞分析是指通過對細胞進行免疫熒光染色，經過流式細胞儀分選熒光細胞或分析熒光細胞所占總體細胞的比例。流式細胞分析可以檢測細胞周期分布、細胞亞群等，是一種強大的實驗工具。
流式細胞分析操作過程視實驗目的而定，下面以碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色法流式細胞技術分析細胞周期為例介紹。

實驗原理

細胞DNA在細胞周期中會進行復制和分裂，隨著細胞周期的進行，單個細胞中的DNA含量會發生相應的變化。PI可以插入DNA和RNA的堿基對中，使用時需用RNase處理細胞，以排除RNA對DNA熒光定量精度的影響。通過流式細胞技術分析細胞群的PI的熒光分布，從而分析DNA含量的分布，進而分析細胞周期的分布。

主要試劑

0.25％Trypsin、細胞基礎培養液、DPBS、70%酒精、5mg/mL RNase溶液、100μg/mLPI染液

主要設備

300目尼龍濾膜、15 mL離心管、流式管

實驗步驟

（1）消化。從培養箱中拿出待染色的細胞，棄去培養液，用DPBS洗兩次，接著用0.25％Trypsin消化4 min，用Trypsin2倍體積細胞基礎培養液。收集細胞懸液至15 mL離心管，1000 r/min離心5min，棄上清。
（2）洗滌。用DPBS液洗一遍，1000 r/min離心5min，棄上清。
（3）固定。緩慢加入-20℃預冷的70%酒精7.5mL，冰浴30min（可以過夜，第二天染色）。
（4）PI單染。用移液器將固定的細胞吹散，用300目尼龍濾膜過濾，收集濾液在15 mL離心管中，1000 r/min離心5min，棄上清。加100μL 5mg/mL RNASE溶液，37℃孵育30min，然后冰浴終止酶作用。加100μg/mL PI染液，室溫避光染色30min。之后可以根據細胞懸液的濃度適當補充細胞培養液或DPBS，用300目尼龍濾膜過濾，收集濾液到流式管中，隨后進行流式細胞檢測分析。
（5）根據PI的激發光波長為488nm，最大發射波長為610-620nm，來選擇所需要的激光器和收集發射波的熒光通道，然后通過調節液路和光路，使得激發光正好打在液流上且聚焦良好。同時在計算機顯示器上設置好程序并繪制好所需要的直方圖。儀器狀態和計算機顯示器就緒后，將收集好濾液的流式管放到上樣管位置，開始上樣檢測。流式不但能檢測出熒光強度，同時還能時時的顯示出各種熒光強度下的細胞數目。
（6）利用流式細胞儀測細胞周期。
圖中橫坐標顯示的是熒光強度相關參數，縱坐標顯示的是每個熒光強度所對應的細胞數目，圖中可以清楚地顯示出G1期，S期，G2/M期的峰，可以對各種熒光強度的細胞進行“設門”，可得到門內細胞數目、門內細胞的百分比、占檢測細胞總數的百分比等，通過分析各峰的細胞百分比，得出處在各時期的細胞比例