流式細胞分選的那些事

將感興趣的目的細胞分離純化出來，一直是細胞生物學中的一個重要研究手段。無論是體外刺激研究細胞因子的表達譜，還是細胞共培養檢測細胞功能，均對細胞的純度具有很高的要求。

目前分離純化細胞的手段主要有兩種：

MACS（magnetic-activated cell sorting），原理就是用結合了磁珠的抗體去標記細胞，讓目的細胞帶上磁珠，通過磁場將結合了磁珠與沒結合磁珠的細胞分離開來。MACS是細胞分選的重要手段，設備簡單，只需要一塊磁鐵，不需要專門的大型儀器，得到的細胞活性好，適合大多數的實驗室。缺點就是能分選的細胞類型有限。

FACS（fluorescence-activated cell sorting），也就是我們今天要了解的流式分選。這部分原理與流式分析一致。利用熒光素標記不同的分子，通過調節合適的電壓、補償等，通過熒光將目的細胞與非目的細胞區分開來。

MACS和FACS的優缺點：

流式分選和流式分析在樣本的準備上具有很多相通的地方，都是把樣本處理成單細胞，最后上樣的時候讓細胞處于單個懸液的狀態。絕大部分人不需要進行儀器的操作，更關心的是如何提高細胞得率以及如果提高分選出來的細胞活性等問題。

首先是樣本的準備，無論是組織還是血液來源的細胞，均應保證細胞在上樣之前處于比較好的狀態。

提示：

• 可以在重懸細胞的時候PBS中加入1%-2%的胎牛血清

• 大部分流式分選儀的上樣器均沒有冷卻系統，要想分選后獲得比較好的細胞活性，應盡量減少細胞在室溫的暴露時間

• 樣本較多的時候可以分成小份體積上樣，每次1ml或者2ml，剩下的放在冰箱冷藏。

  
  

該方法長時間分選的時候能較好地提高分選出來的細胞活性，缺點就是人不能長時間離開，以防止樣品跑空，空氣進入分選管道。

其次，我們來聊一聊分選的模式，一般的流式分選儀上都有三種模式：純化（purify）、富集（enrich）、單細胞（single cell）。我們需要知道的是，流式分選是針對細胞所在的液滴進行操作，而不是針對細胞本身。

三種模式的異同點：

由上表我們可以看到，單細胞模式細胞得率最低，只有液滴中有一個且只有一個目標細胞才會被分選。純化模式分選出來的都是目標細胞，純度和單細胞模式分選一致。富集模式分選出來的純度最低。

那么，如何提高分選效率？答案就是盡可能地使細胞分散成單個細胞狀態。防止細胞粘連，同時細胞密度不宜過大，盡量使每個液滴中只含有一個細胞。在分選之前可將細胞用含EDTA的PBS清洗，去除鈣離子，或者加入適度的DNA酶，去除死細胞DNA產生的粘連。EDTA可能會對檢測造成一定的影響，具體細胞還得具體分析。

最后，細胞分選出來后我們需用離心管或者流式管收集，為了保證細胞的活性，收集管里需要放置一定的培養液，起到緩沖作用也可以給細胞提供一定營養。如果分選出來的細胞需要進行培養，還可在收集管中加入一定濃度的抗生素。如果分選環境不是特別干凈，切記收集后要用含抗生素的PBS進行清洗，再用含抗生素的培養基進行培養，以防止細胞污染。

流式分選可用的很多，特別提出的一點是它除了可以進行四路分選以外，還可以分選單細胞，直接用96孔板進行收集，可以往每個孔里都只分選1個細胞。對于篩選細胞穩轉株或者做單抗的同學來說可以大大縮短篩選細胞單克隆的時間。