流式細胞術在血液學中的應用（一）

DNA倍體分析及細胞周期分析

    在細胞周期內,DNA含量隨細胞內時相發生周期性變化,正常情況下,大多數細胞處于休止期(Go), G1期細胞雖有DNA合成，但DNA含量仍為2N，為二倍體細胞,;處于活躍的DNA合成期(S期)的細胞DNA含量為2N-4N;正經歷細胞分裂(G2/M期)的細胞含有最大量的DNA(4N)。細胞經固定后用PI(Propidium  Iodine 碘化丙啶)等熒光染料染色即可上機測定。但標本需先經RNA酶處理以排除RNA干擾。FCM可在測量大量細胞(數分鐘可測定105個細胞)后給出DNA分布直方圖,見圖12.10.正常人外周血DNA示意圖，圖中第一個峰(G1)是DNA含量為2N 的細胞峰, 第二個峰是DNA含量為4N 的細胞峰,兩峰之間是DNA含量為2N-4N的處于活躍的DNA合成期(S期)的細胞。用廠家提供的Multicycle軟件，計算機可自動計算出G1%、S+G2M%;如用DNA/RNA雙參數分析,可得到G0:G1%,G0/G1期DNA指數, 如標本中有凋亡細胞,在G1峰前會出現一個亞G1期峰,軟件可自動計算出凋亡細胞的%。
圖12.10.正常人外周血DNA示意圖(采自Coulter Training Guide)
DNA倍體分析的臨床有價值的指標是DNA非整倍體和/或超二倍體%和四倍體%增高。這些改變是腫瘤細胞的特異性改變,和實體瘤相比,急性白血病非整倍體發生率較低,約30～40%。

淋巴細胞亞群測定

    淋巴細胞擔負著免疫的主要功能。淋巴細胞亞群的測定有助于了解機體免疫狀況及一些疾病的監測。臨床經常測定的淋巴細胞亞群包括T淋巴細胞 (CD3+), T 輔助細胞 (CD3+CD4+), T 抑制細胞(CD3+CD8+), B 淋巴細胞（CD19+或CD20+），NK 細胞 (CD3-CD56+)等。
常用來測定淋巴細胞亞群的單克隆抗體(Monoclonal  Antibody McAb)都是小鼠抗人Ig,有精制抗體,有直標熒光抗體,現在一些國外公司有雙色和三色McAb出售,如CD4-FITC/CD8-RD1、CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等,此時應根據這些雙色或三色McAb的Ig性質選擇相應的陰性對照,如MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC等。上機測定時應先測定陰性對照管,陰性對照的陽性細胞應＜2.0%。
三色測定可給出更為準確的各亞群的情況:如真正的T 輔助細胞應是 CD3+CD4+CD8-, 真正的T 抑制細胞應是 CD3+CD4-CD8+,單標CD8+細胞中不僅有T 抑制細胞,還含有30%左右的NK細胞;而CD3+CD4-CD8-細胞群是γδT細胞,此類細胞與感染有關, CD3+CD4+CD8-細胞+CD3+CD4-CD8+細胞+CD3+CD4-CD8-細胞+CD3+CD4+CD8+細胞=CD3+細胞。如單標記CD56不能準確測定NK 細胞,NK 細胞應是 (CD3-CD56+),因為CD56+細胞中包含著非HLA束縛細胞毒T 細胞(CD3+CD56+)。雙色組合還能測定B 淋巴細胞（CD3-CD19+或CD20+）、激活的T 細胞(CD3+CD69+或CD3+25+)等。
應用適當的雙色組合如CD4與CD29,CD4與CD45RA,可以測定T輔助細胞的的亞群。如CD4+2H4(CD45RA)+細胞是Ts的誘導細胞;CD4+4B4(CD29)+細胞Th的誘導細胞。同理,利用CD8+CD45RA和CD8+CD29+S6F1可測定T抑制細胞的亞群。
T輔助細胞還可分成Th1、Th2兩個亞群，同時標記細胞內細胞因子IFN-γ和IL-4，可區分Th1細胞（CD4+/ IFN-γ+）和Th2細胞（CD4+/ IL-4+）。
利用CD25、CD69等McAb和其他淋巴細胞標記雙色或三色標記還可測定淋巴細胞亞群的功能狀態，如活化T8、活化B細胞等。
    以下給出常用細胞亞群的正常范圍供參考,請注意同一CD中有多種克隆的McAb, 同一CD中不同McAb所測出的數值不同,每個實驗室應測定自己實驗室的正常數值。
    CD3+             70.0±12.0%      +4B4+                23.0±7.0%
    CD3+CD4+CD8-      40.0±9.0%         CD4+2H4+                19.0±6.0%
    CD3+CD4-CD8+      30.0±8.0%
CD3-CD56+(NK)     12.0±8.0%

白血病免疫分型原理

    白血病免疫學分型是利用單克隆抗體(McAb)檢測白血病細胞的細胞膜和細胞漿抗原,分析其表現型,以了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。對白血病細胞抗原的分析研究有助于對白血病分型,為診斷和治療提供依據。白血病免疫分型是形態學分型的重要補充和進一步深化，國際MIC分型協作組認為每一例急性白血病的免疫分型都是必不可少的。白血病免疫分型對鑒別急淋和急非淋有決定作用，對鑒別急非淋的某些亞型如M7、M3也有決定作用，對于一些用形態學、細胞組織化學不能診斷的急性白血病，急性未分化白血病，混雜性白血病等有重要意義。自從單克隆抗體問世以來,最成功的應用就是研究造血系統各類細胞表面抗原與細胞增殖、分化及惡變的關系。研究發現細胞表面抗原有重要功能,一些抗原分子作為細胞生長因子的受體而影響細胞的增殖分化;一些抗原分子作為細胞間相互識別的物質基礎而參與細胞間相互作用;一些抗原分子則是細胞特異功能的物質基礎。
    從多能造血干細胞(PHSC)分化成熟為功能細胞過程中, 細胞表面和細胞漿內抗原隨著分化成熟過程不斷發生改變, 這些抗原稱為造血細胞分化抗原。造血細胞分化抗原是造血細胞分化過程中由細胞核內染色體上的基因編碼的鑲嵌蛋白, 其出現、增多、減少或消失與造血細胞分化密切相而表現出與細胞系列及分化程度相關的特異性。這些抗原可作為鑒別和分類造血細胞的標記。如髓系細胞的MPO、CD33、CD13、CD14、CD15等抗原;巨核系的CD41、CD41、CD61抗原; T淋巴細胞的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等抗原;B淋巴細胞的CD19、CD20、CD22等抗原。至今尚未發現白血病細胞特異性抗原，而白血病細胞是造血細胞在某一分化階段的大量積累,表達與之相應的造血細胞分化抗原，因此可用造血細胞分化抗原類標記檢測白血病細胞; 但白血病細胞畢竟不是正常造血細胞,其抗原表達與正常造血細胞并不完全相同。常有丟失某一分化發育階段正常應有的抗原,或表達某一分化發育階段正常不應有的抗原，或表達其他系列抗原，部分喪失了系列專一性和分化的嚴格性。
用FCM檢測白血病免疫分型具有快速、簡便、重復性好等優點。由于FCM可根據FSCνSSC直方圖區分細胞并可圈定檢測細胞范圍(Bitmap，無定型門),或用SSC(線性或對數)和CD45直方圖圈定檢測細胞范圍(Bitmap，無定型門)，排除其他細胞干擾，因此較光學顯微鏡免疫熒光法或免疫組化法結果更準確。