流式細胞術急性分離小鼠小膠質細胞

實驗概要

本文主要講述了：從成年小鼠腦中分離單細胞，制成單細胞懸液，我們一個單細胞分離成單細胞懸液，除去髓鞘碎片，然后染色標記，以確定小膠質細胞的成分。細胞被固定，在多色流式細胞儀上讀取。

實驗步驟

1. 小鼠用pH值7.4，0.1M PBS徹底穿心灌注。
2. 用剪刀去頭。
3. 剝開頭骨的軟組織。
4. 除去下頜骨。
5. 除去頭骨延髓到上頜骨之間的組織。
6. 手術剪刀，取出頭骨頂部，順時針方向切割，開始和結束于右后鼓膜鉤。
7. 舀出大腦，維持組織的完整性。
8. 立即將腦組織置于預冷的流式細胞術緩沖液中（1％BSA 1mM的EDTA的 pH值7.4 0.1M PBS，50U/ml DNAseI）。如果計劃標記神經元，應在緩沖液中添加l-谷氨酸以防止在制備過程中的神經細胞死亡。
9. 用杜蒙5＃鑷子從大腦的外表面仔細剝離腦膜（硬腦膜、蛛網膜和軟腦膜）。
10. 使用手術刀作冠狀切口分離大腦和小腦/腦干。
11. 使用鑷子分離小腦和腦干,小心剝離出第四腦室腦膜襯砌。
12. 使用手術刀，縱向平分，小心剝離出大腦脈絡叢及相關的腦膜組織。
13. 進一步解剖到所需分析的腦區（如海馬，大腦皮層等）。
14. 將腦組織轉移到15MLTenbroeck homogenizer中，其中含有10毫升冰冷的FACS緩沖液。
15. 輕柔震蕩3次破碎組織。
16. 粗勻漿，經過70微米尼龍網狀帶有塑料柱塞的細胞過濾裝置，每柱2次，產生單細胞懸液。
17. 離心細胞，4oC， 1200 轉/10min，棄掉上清液，再加上細胞流式細胞儀的緩沖液。
18. 用Miltenyi AutoMACS除去髓磷脂，根據指示髓鞘去除珠。
19. 1× 流式細胞儀緩沖液洗細胞，4oC，1100轉/10min，棄掉上清液。細胞重置在100 UL預冷的，細胞流式細胞術的緩沖液中再轉至細胞流式細胞儀管中。
20. 把細胞標記上帶有抗CD11b，CD45的細胞外的小膠質標記物、可修復的LIVE/DEAD染料或者任何其他所需標記（例如GFAP，NeuN，CD3e等），4度避光反應30min。
21. 洗滌細胞2次，如步驟19所示。
22. 在100-400uL含1％PFA PBS溶液(0.1M，PH=7.4)中重新懸浮細胞。4℃避光存儲。
23. 在流式細胞儀檢測細胞。
24. 首先用LIVE/DEAD設置gate，選擇活細胞，然后依據脈沖寬度與面積比選擇線性分布細胞，依據前向散射與側散射比來消除碎屑。然后依據不同細胞類型的相應標記來獲得等效和準確的細胞計數。

小膠質細胞分離流程示意圖，如圖1