流式細胞術里的大難題——同型對照

抗體的Fab段可能會出現與細胞表面發生低親和力、非特異性結合的現象，尤其是細胞死亡時或是胞膜受損，這種非特異性結合會更加明顯。所以，平時實驗中大家經常會用同型對照來確定背景熒光水平。

我們知道同型對照曾經是流式細胞術中的經典陰性參照，然而要達到同型對照與抗體的交叉反應能力完全一樣，就要求亞型、物種、熒光素、熒光素：蛋白質比例、濃度等各方面指標均能達到一致，暫且不提自己是否能夠挑選正確，就連廠家都不一定每次能夠做到完全一致，所以要找到一個與抗體背景染色完全匹配的同型對照是非常有難度的。

所以，為了避免大家在設置同型對照時出現一些不必要的誤區，我們對同型對照適用情況進行了總結，并歸納出哪些情況下不需要用到同型對照的，以及使用同型對照需要注意的地方。具體事項如下：

1、如果抗原表達情況是為雙峰分布，并且陰性峰和陽性峰明顯清晰的分開，通過雙峰的分布就可以了解實驗結果，這時同型對照就不需要設置了。

2、如果需要檢測的是經過培養的細胞，那么此時設置同型對照，也只能得到一些反映細胞粘附能力的信息，并且很難得到反映其非特異性熒光的信息。故檢測培養后的細胞，設置同型對照是不理想的。

3、如果實驗中同時用到多種熒光素，進行分析時，發現熒光滲漏對結果影響較明顯，而且背景熒光不明顯，此時就不宜設置同型對照，在這種情況下FMO對照是最好的選擇。（FMO對照是指用同種細胞，染上去掉一種熒光素的其它所有熒光素，這樣可以使各種熒光素對未標記通道的滲漏體現出來，使得能夠將門放在合適的位置，因此，是設門所必需的對照。而且FMO對照只是在需要準確區分陽性、陰性時才是非常重要的。FMO對照現在已普通應用于多色實驗，而且是多色實驗所必需的。）

4、在使用同型對照時，發現非特異性結合水平很高，可能是由于非特異性的Fc端和細胞發生結合，就產生了非特異性信號，那么就要注意進行Fc阻斷了。

5、要明白同型對照僅僅是參考，幫我們過濾掉一些影響實驗的因素，但是不能憑此就判定陽性陰性分界點或以此設門，我們要知道同型對照只能反映非特異性結合的背景熒光，而背景熒光，還會由其它因素引起，例如自發熒光、補償高、抗體、標記方法、儀器、其它試劑或數據分析等因素都會影響背景熒光。

6、需要進行目標抗體的滴定，以降低非特異性結合的背景熒光，也是不宜設置同型對照的。因為抗體量過多，會造成陰性峰的偏移和基底增寬。

7、如果實驗中對于細胞信號轉導和細胞因子進行檢測，不僅要設置FMO對照，還需要設置生物學陰性對照，特別注意未刺激細胞或用磷酸化抑制劑處理的細胞。

8、在多色方案中要加入細胞活性染料，用來除去死細胞。因為死細胞的非特異性染色很強，若是沒有除去，會導致較高的非特異性結合，影響實驗。

9、除了同型對照，根據不同情況也可以設置其他的對照 。例如對于未染色的細胞，確定背景和自發熒光的陰性對照，設置PMT電壓; 完全染色的細胞，確定一些超出坐標軸的事件,設置PMT電壓; 單染的細胞/微球，調節補償; 未刺激或未處理的樣本，實驗陰性對照；陽性細胞（刺激或特殊藥物處理過的），實驗陽性對照。