流式熒光液芯技術的原理及其應用

   曾經在2000年前后經歷過輝煌發展的傳統生物芯片，經過10年左右的應用，科學家們終于有了些更客觀和更清醒的認識，同時產業界也衍生出了更專業更具特點的新型生物芯片。傳統基于玻璃片、硅片、膜片的所謂“固態芯片”是生命科學研究領域中非常優秀的科研工具，它們的共同特點是在固態基材上極小的面積里合成或固定上許多核酸或蛋白探針，芯片上的每個或幾個點代表一個基因或蛋白。利用生物芯片，科學家們可以通過一個實驗對成千上萬的基因或蛋白指標進行分析。但遺憾的是，這些芯片的致命弱點就是其信息質量的穩定性和可重復性比較差，操作也較繁瑣。正因為如此，芯片的臨床應用受到了很大的限制。與固態芯片“數據量多，數據質量差”的特點相對，美國Luminex公司開發的流式熒光-液芯系統，以“高通量，高質量，全定量，3維雜交，靈活組合”等特點，成為正在崛起的一種臨床應用型的高通量代表性技術。

流式熒光-液芯的概況

    美國Luminex 公司開發出的流式熒光-液芯技術平臺是一種全新概念的生物芯片。該技術的核心是把微小的聚苯乙烯微球（5.6um）用熒光染色的方法進行編碼，目前共有100種編碼。每種熒光編碼微球分別共價交聯不同的基因探針或抗體抗原。應用時，把針對不同檢測物的熒光編碼微球混合后再加入微量病人標本，在懸液中靶分子與微球進行特異性地結合；最后Luminex流式點陣儀的兩束激光對微球進行逐顆分析，并得出每種標志物的信號和濃度。相比固態芯片的反應動力學，液芯技術中的捕獲分子和被捕獲分子都在運動，故碰撞幾率很高，反應速度很快，可以視作三維的反應動力學。該高通量的技術從產品本身外觀上看，沒有傳統固態芯片那種有型的玻片或膜片基材，其含微球的溶液肉眼觀是澄清透明的，所以又有“液態芯片"之稱。

    液態芯片技術平臺應用非常廣泛，編碼微球上可以包被蛋白也可以連接核酸，所以液態芯片既可以用來檢測蛋白（蛋白芯片），也可以檢測核酸變化（基因芯片）。早在1997年，《臨床化學》雜志就刊登專文介紹多功能Luminex流式點陣儀及其技術，并將其譽為“真正的臨床應用型生物芯片”。隨后，運用Luminex流式點陣儀及其技術進行臨床診斷和基礎研究成為生命科學研究領域的一大熱點，相關的研究論文頻頻刊登在《臨床化學》、《臨床與診斷免疫學》、《臨床微生物》、《基因組研究》、《蛋白質組研究》、《癌癥》等國際權威學術雜志上。2001年7月27日，INOVA公司的ENA系列流式點陣試劑率先通過美國FDA的嚴格認證，標志著多功能流式點陣儀及其技術得到了美國官方的認可，并由此成為首個，也是目前唯一得到美國FDA許可用于臨床診斷的多指標并行檢測技術。2005年6月9日，基于液態芯片技術的學術論文刊登在當日出版的《自然》雜志上，這是學術界認可一項技術所能給予的最高榮譽。2005 年11 月，為了表彰其對臨床診斷技術進步做出的革命性貢獻，全球科技產業和行業研究的權威機構――Frost & Sullivan―授予xMAP技術“2005年度國際臨床診斷技術革新大獎”，標志著液態芯片技術在國際臨床診斷技術領域的領軍地位得到了最具權威的認可。

流式熒光-液芯技術的比較優勢

高效：因為許多編碼的聚苯乙烯微球可以放在同一個反應體系內，所以一次可同時檢測多種（100種）生理病理指標。這與傳統逐個檢測的方式效率有很大的不同。

高敏感：每個聚苯乙烯微球上都以共價結合的方式包被上許多抗原、抗體或核酸分子，因其參與反應的分子多，產生的信號就強。另外信號閱讀時用的是激光激發熒光的方法，這種方法也是發光的方法之一，其靈敏度明顯比酶學顯色的方法高，與各種化學發光的方法類似。據Qiagen公司的報道，用該平臺檢測IL－8時，其靈敏度為0.01pg，達到了非常驚人的水平。

快速：因為雜交或免疫反應在懸浮的液相中進行，所以反應時間短，雜交后常不用清洗就可以直接讀數，所以檢測效率大大高于固相雜交。所用時間從幾小時縮短到十幾分鐘。

重復性好：固相芯片不能很好地應用于臨床診斷，其中一個重要的原因是其重復性差，這是固相芯片目前難以克服的技術障礙。但流式熒光液芯技術其分子反應發生在均相的液體環境中，其結果穩定，重復性非常好，在一個反應體系中針對每個指標有1000－5000顆相同的微球，即相同的反應單元；檢測時，抽取其中的100－500顆讀數，最終的數據是取其均值，這樣已經把誤差減到最小，而固相芯片每個指標只有1－2個數據，其數據的可靠性相對較差。

液態芯片技術在生命科學中的應用

    在液態芯片平臺上可以開發許多產品，根據目標檢測物的不同，可大致分成兩大類，一類是蛋白芯片，另一類是基因芯片。蛋白芯片基于的原理是抗原抗體的特異性相互作用，它所檢測的目標物是蛋白；基因芯片是基于核酸分子雜交理論來設計的，它所檢測的目標物是核酸。

    國外目前有60余家公司正在研究基于液態芯片技術的產品。有的是主要應用于生命科學研究和藥物研究的，有的是用來臨床診斷，主要涉及的領域有：過敏源篩查，自身免疫病，腫瘤標志物，心血管疾病標志物，細胞因子，內分泌和激素，組織分型，感染性疾病檢測，激酶和磷酸化，金屬蛋白酶類。

    自2001年7月INOVA DIAGNOSTICS公司的ENA四聯檢通過FDA認證以來，截止2008年底，基于液態芯片技術平臺，已有48項檢測試劑（超過200種指標）通過FDA的嚴格認證，進入臨床應用。涵蓋的領域包括自身抗體譜、呼吸道病毒核酸譜、常見過敏原抗原及抗體譜和囊性纖維病的基因突變譜等方面。

在國內，國家食品藥品監督管理局目前已經批準了兩大類產品，即腫瘤標志物定量檢測試劑和HPV核酸檢測試劑。這兩類產品都是由上海透景生命科技有限公司研制和生產的。

液芯在腫瘤標志物檢測中的應用

    腫瘤的發生發展是一個多因素、多階段、多基因變異累積的復雜病變過程。近年來，合理選擇幾項靈敏度、特異性能互補的腫瘤標志物進行組合檢測逐漸成為共識。“液態芯片”出眾的高通量檢測性能正好契合了臨床腫瘤標志物應用的需求。它的基本原理是，在不同熒光編碼的微球上共價交聯針對不同腫瘤標志物的抗體，把這些帶有抗體的微球混合，加入血清后與血清中相應的抗原結合，然后熒光抗體再與抗原結合，最后上機檢測，通過兩束激光分別檢測微球編碼和熒光信號，實現對多種腫瘤標志物的聯合檢測。

    流式熒光-液芯技術與化學發光、電化學發光技術一樣同屬發光類技術之一，具有靈敏度高、重復性好、線性范圍廣等優點，同時又由于其獨特的檢測原理，液態芯片具備了其他發光類技術所不具備的高通量檢測能力，代表了臨床腫瘤標志物檢測的應用趨勢。2009年3月，在該技術平臺上SFDA已經頒發了12項常用腫瘤標志物的醫療器械注冊證（包括AFP、CEA、CA125、CA19-9、t-PSA、f-PSA、NSE、CA72-4、SCCA、Cyfra21-1、CA242 和 free-β-hCG）。隨著液態芯片腫瘤標志物檢測試劑獲得市場準入，逐漸進入臨床實驗室和各大體檢機構，其強大的檢測能力和高質量的檢測數據迅速引起了國內臨床檢驗界的廣泛關注。

    現有的腫瘤標志物檢測方法主要有：酶聯免疫法、放射免疫法、發光法、固態（膜基）芯片法。固態芯片（蛋白芯片）也是一種多指標檢測技術，由于其捕獲與被捕獲分子之間的反應特點，準確性和重復性存在一定的缺陷。目前用于腫瘤標志物檢測的主流試劑屬于化學發光免疫分析與電化學發光免疫分析兩大類，前者以美國的雅培（ABBOTT）、貝克曼（BECKMAN），德國的拜耳（BAYER）為代表，后者為瑞士羅氏（ROCHE）的ZL技術。

以下就Luminex流式點陣儀與化學發光/電化學發光儀的主要性能指標作簡要對比（見下表）：

流式熒光-液芯技術在HPV檢測上應用

    高危型HPV感染與宮頸癌的發生關系密切。文獻報道與宮頸癌有關的高危亞型約有20種。目前用于HPV檢測的試劑主要是流式熒光雜交法、固態膜雜交方法和雜交捕獲方法三大類，固態膜芯片以導流膜雜交、反向膜雜交為代表，雜交捕獲法的代表是美國Digene（現為Qiagen）公司的HC2產品。以膜雜交為基礎的方法，其設備費用低廉，使用門檻低。各種膜雜交方法通常采用的是膜片雜交、酶聯顯色、肉眼或掃描觀察顏色深淺來判斷結果，而流式熒光雜交法的HPV檢測，采用的是微球雜交、激光熒光定量檢測、數字信號，相比較而言具有多方面的優勢。

以下就Luminex流式點陣儀與現階段流行的HPV檢測方法的主要性能指標作簡要對比：