試劑、試劑盒 10×RSB 溶液 10%SDS 蛋白酶 K lOXLiCI 溶液 RSB 飽和的酚 氯仿 異戊醇 2mol L 乙酸鈉 無水乙醇 TSE 溶液 LiCl 緩沖液平衡酚 TSE 飽和酚 4mol LLiCL
實驗步驟
一 材料與設備
1. 酚提法
1)10×RSB 溶液：O.Olmol/LTris，O.OOlmol/LKCl,0.0015mol/LMgCL2
2)10%SDS
3) 蛋白酶 K，5 mg/ml
4)lOXLiCI 溶液:5%SDS，0.lmol/L 乙酸鈉，1.4mol/LLiCl。
5)RSB 飽和的酚.
6) 氯仿：異戊醇 (24:1)
7)2mol/L 乙酸鈉。
8) 無水乙醇。
2.LiCl 提取法
1)TSE 溶液。
2)10%SDS,
3) 蛋白酶 K(10 mg/ml)。
4)lOXLiCl 溶液：5%SDS，0.lmol/L 乙酸鈉，1.4mol/LLiCl
5)LiCl 緩沖液平衡酚
6) 氯仿
7)2mol/L 乙酸鈉
8) 無水乙醇，
3) 酚-SDS 提取法
1)TSE 溶液
2)10%SDS
3)TSE 飽和酚
4)4mol/LLiCL
5)2mol/L 乙酸鈉。
6) 無水乙醇。
二 操作方法
1. 酚提法
1) 在 4 ml 純化病毒懸液中加 1/10 容量 1OXRSB，0.12 ml10%SDS，0,4 ml 蛋白酶 K, 置 56℃15 min
2) 在上述溶液中加 0.8 mllOXLiCl 溶液和 4 ml 用 RSB 飽和的酚，56°C 振搖 5 min, 立即冰浴。
3) 加 4 ml 氯仿：異戊醇（24:1)，室溫搖 15 min,3000r/min，離心 10 min。
4) 取上層水相，再加 4 mlRSB 飽和酚和 4 ml 氯仿：異戊醇，如此重復 1?2 次
5) 取上層水相，加 0.1 倍體積的 2mol/L 乙酸鈉，2.5 倍體積的無水乙醇,-20℃ 或-70℃ 下保存。
2.LiCl 提取法
1) 純化病毒重懸于 2 mlTSE 中，加 70ul10%SDS(終濃度為 0.3%), 再加 100ul 蛋白酶 K(10 mg/ml)，置 56℃ 下 15 min。
2) 加 0.2 ml10XLiCl 緩沖液，1 ml 用 LiCl 緩沖液平衡的酚溶液，輕揺，2000r/mm 離心 5 min
3) 取上層酚相，加 0.5 ml1XLiCl 溶液，提取 1 次，2000r/min 離心 5 min
4) 取上層水相與 3) 中所得到的下層水相混合，再加 1.2 mlLiCl 平衡的酚，輕搖，2000r/min 離心 5 min。
5) 棄上層酚相，加 1.2 ml 氯仿，輕揺，2000r/min 離心 5mim。
6) 取上層水相，加 0.05 倍體積 2mol/L 乙酸鈉倍體積的無水乙醇，在-20°C 或-70℃ 保存
3. 酚-SDS 提取法
1) 將純化病毒重懸于 2 mlTSE 中，加 0.2 ml10%SDS，輕搖至懸液澄清為止。
2) 加 2 mlTSE 飽和酚，在冰浴中輕搖 5 min,3000r/mim 離心 lOmin。
3) 取上層水相，再用 TSE 飽和酚提取 2?3 次。
4) 取上層水相，加 100ul4mol/LLiCl，0.05 倍體積 2mol/L 乙酸鈉，2.5 倍體積的無水乙醇，在-20°C 或-70℃ 下保存。