流程化、更高效的基因編輯工具：打開腸道微生物組“窗口”

　　基因，就像是指揮官手里拿著的建筑總圖紙，調控著生物體的一切生命活動。這份施工的圖紙決定了整個建筑的所有呈現形式。那怎么才能對“圖紙”——基因進行編輯呢？CRISPR/Cas編輯系統被認為是最佳的一種工具。

　　1月6日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所、深圳合成生物學創新研究院戴磊課題組在ACS Synthetic Biology上發表最新成果，研究團隊開發了針對人體腸道擬桿菌的CRISPR/Cas編輯系統，可以對人體腸道擬桿菌的“圖紙”進行修改，具有可進行流程化操作和無篩選標記、編輯效率高等特點。團隊成員鄭靈剛和譚揚為共同第一作者，戴磊為最后共同通訊作者。

　　“該方法突破了傳統方法在編輯效率、基因簇刪除和多基因編輯方面的瓶頸，為進一步理解腸道微生物組的功能以及活菌藥物的開發奠定了技術基礎。”戴磊表示。

　　讓CRISPR/Cas“操刀” 打開腸道微生物組“窗口”

　　腸道擬桿菌屬作為腸道中數量最高的細菌之一，被視為研究腸道微生物組的“窗口”，研究腸道擬桿菌可以為研究其他腸道微生物提供基礎。此外，擬桿菌屬細菌也與肥胖、炎癥性腸病和結直腸癌等多種疾病相關。目前對于人體腸道菌擬桿菌屬已有的基因遺傳操作工具存在諸如流程復雜、編輯效率低等缺點，限制了進一步對腸道菌群和人體健康的研究。

　　如果可以進一步開發腸道擬桿菌的CRISPR/Cas編輯系統，將為研究其他腸道微生物打通“道路”，也為治療人類多種疾病提供更多可能性。為了獲得簡便、高效的遺傳操作工具，研究團隊設計了基于CRISPR/Cas的編輯系統，可以根據研究者的需要，構建無篩選標記的擬桿菌突變株。

　　那么“操刀”師傅CRISPR/Cas是如何流程化操作的呢？

　　首先，研究人員使用穿梭質粒作為“馬車” ，讓其攜帶“涂改”工具（剪刀和修復畫筆，即Cas基因和修復模板）進入細菌內部。在接收到需要涂改的命令（加入誘導劑）后，Cas基因將表達出來的Cas蛋白作為“剪刀”，剪開gRNA靶向的基因位置，完成對目標片段的刪除。其次，在有修復模板（修復畫筆）存在時，隨即可將修復模板通過同源重組的方式插入到目標位置，完成基因的插入。最后，通過在培養基中傳代，從而實現獲得無篩選標記的擬桿菌突變株。利用此方法，可流程化地獲得腸道工程菌，為未來活菌藥物的設計與構建提供新的工具。

　　CRISPR/Cas編輯示意圖 來源：科研團隊供圖

　　高效、多功能的基因組編輯工具

　　擬桿菌屬的傳統編輯工具的效率為4%-25%之間，該研究團隊通過利用CRISPR/Cas系統，使其編輯效率可以達到80%-100%。這將極大地促進對腸道菌群和人體健康的基礎和應用研究。

　　“馬車”、“剪刀”等工具在此過程中都起著舉足輕重的作用，該團隊在擬桿菌屬中測試了不同的CRISPR/Cas系統。發現使用誘導型啟動子表達FnCas12a蛋白（剪刀），可以實現高效的基因編輯。基于此，團隊測試該系統在多形擬桿菌中可以實現大片段的刪除和外源基因的高效插入。

　　“外源基因GFP是一個熒光蛋白，若能成功插入到基因組中，即可觀察到菌體發出綠色熒光，供我們查看‘涂改’成功與否。”戴磊表示。

　　基因簇的刪除和外源基因的插入 來源：科研團隊供圖

　　此外，該系統也成功在卵形擬桿菌、脆弱擬桿菌、普通擬桿菌、單形擬桿菌等多個物種中實現高效率的基因編輯。

　　高效、精準的基因組編輯方法對于解析腸道微生物組的功能、開發工程腸道益生菌都是不可或缺的工具。與之前針對擬桿菌屬基因基因遺傳操作工具相比，該團隊基于CRISPR/Cas系統的工具極大的提高了基因編輯的效率，同時也更容易實現無篩選標記突變株的獲得。戴磊表示，未來，該技術將推動腸道菌群與人體健康的機制研究，有望實現重大慢性疾病的預防和治療。